הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.
Abstract
לחיות הדמיה בזמן התמונה התמונה הוא כלי חשוב בביולוגיה התא המספק תובנה תהליכים סלולריים שעלולים להתעלם אחרת, לא מובנת, או שלא כהלכה על ידי ניתוח תא קבוע. בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח הוא חזק ומספיק כדי להתבונן הסלולר המצב הנייד, זה יכול להיות מוגבל בהגדרת סדר הזמן של אירועים ברמה התאית והוא חולה להעריך את האופי הארעי של תהליכים דינמיים כולל התקדמות mitotic. לעומת זאת, הדמיה של תא חי היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ברמה של תא בודד לאורך זמן ויש לו את היכולת ללכוד את הדינמיקה של תהליכים שאחרת היו מיוצגים בצורה גרועה בהדמיית תא קבוע. כאן אנו מתארים גישה כדי ליצור תאים הנושאים מסמנים התווית של כרומטין ו microtubules ואת השימוש שלהם בגישות הדמיה של תא חי כדי לפקח על יישור כרומוזום מטאפיפאסיים ויציאה mitotic. אנו מתארים טכניקות מבוססות הדמיה כדי להעריך את הדינמיקה של היווצרות ציר והתקדמות mitotic, כולל זיהוי של תאים בשלבים שונים מיטוזיס, זיהוי ומעקב של פגמים mitotic, ניתוח הדינמיקה ציר ו mitotic הגורל התא בעקבות הטיפול עם מעכבי mitotic.
Introduction
ניתוח מבוסס תמונה של תאים קבועים משמש בדרך כלל להערכת השינויים ברמת האוכלוסייה התאית בתגובה לרטבאליות שונות. בשילוב עם סנכרון תאים, ואחריו אוסף והדמיה של נקודות זמן טוריות, ניתן להשתמש בגישות כאלה כדי להציע רצף אירועים תאי. עם זאת, הדמיה סלולרית קבועה מוגבלת ביחסים הזמני משתמעת לאוכלוסיה ולא הפגינו ברמה של תאים בודדים. בדרך זו, בעוד הדמיה תא קבוע ניתוח מספיק כדי לבחון פנוטיפים חזקים ושינויים במצב יציב, היכולת לזהות שינויים זמניים לאורך זמן ושינויים המשפיעים רק על אוכלוסיית התאים הוא לא מושלם. לעומת זאת, הדמיה של תאים חיים היא כלי רהוט שניתן להשתמש בו כדי להתבונן בתהליכים סלולריים ומשניים בתוך תא אחד, או באוכלוסיית הסלולר, לאורך זמן וללא סיוע של גישות סנכרון העלולות להשפיע על עצמם על התנהגות תאית מיכל בן , מיכל השני , מיכל שלוש , ד , מיכל 5 , . שישה מטרים
היווצרות של ציר דו קוטבית mitotic הוא חיוני עבור ההפרדה כרומוזום הנכון במהלך חלוקת התא, וכתוצאה מכך שתי תאים מבחינה גנטית ביתי. פגמים במבנה mitotic ציר כי מושחתים mitotic התקדמות ולהתפשר על נאמנות של הפרדה כרומוזום יכול לגרום לדיוויזיות תאים קטסטרופלי ויכולת הכדאיות של תאים מופחתת. מסיבה זו, mitotic רעלים שמשנים את היווצרות הצירים מבטיחים therapeutics להגביל את ההתפשטות המהירה של תאים סרטניים7,8,9. עם זאת, ניתוח תאים קבוע של מבנה הצירים בעקבות הוספת רעלים mitotic מוגבל ביכולתה להעריך את התהליך הדינמי של היווצרות צירים ואינו יכול לציין אם שינויים שנצפו במבנה הצירים הם קבועים או מ במקום ארעי וניתן להתגבר על מנת לאפשר חלוקת תאים מוצלחת.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה כדי להעריך את הדינמיקה של מיטוזיס רטבאליות בעקבות הדמיה של תאים חיים. שימוש בשורה hTERT מונצח-1 קו התא ההונדסים לבטא RPE-מתויג Histone 2B כדי להמחיש כרומטין, יחד עם EGFP-מתויג α-טובולין כדי להמחיש microtubules, את העיתוי של יישור כרומוזום מטאפיאט, אנאפיום התחלתה, ובסופו של דבר mitotic הגורל התאים מוערך באמצעות רמזים חזותיים של תנועת כרומוזום, compaction, מורפולוגיה גרעינית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרזולוציה הטמפורלית המסופקת על ידי הדמיה בזמן מאפשר להדמיה והערכה של אירועים סלולריים רציפים בתוך תאים בודדים. גישות העושות שימוש בסנכרון הסלולר ולאחריה האיסוף והקיבעון של תאים בנקודות זמן רציפות מוגבלות בהשוואות שבוצעו בסופו של דבר בין אוכלוסיות של תאים. בהקשרים שבהם התגובה התאית רטבא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM נתמך על-ידי NSF GRFP. ALM נתמך על ידי מימון פרס משפחת סמית ‘ למצוינות במחקר ביו-רפואי.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
