Live Cell Imaging для оценки динамики метафазных сроков и клеточной судьбы после Митотической Spindle Perturbations
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки динамики формирования шпинделя и митотического прогрессирования. Наше применение замедленной визуализации позволяет пользователю идентифицировать клетки на различных стадиях митоза, отслеживать и выявлять митотические дефекты, а также анализировать динамику шпинделя и судьбу митотических клеток при воздействии антимитотических препаратов.
Abstract
Визуализация замедленного времени в живых клетках является важным инструментом в клеточной биологии, который дает представление о клеточных процессах, которые в противном случае могли бы быть упущены из виду, неправильно поняты или неправильно истолкованы анализом фиксированных клеток. В то время как визуализация и анализ фиксированных клеток надежны и достаточны для наблюдения за клеточным устойчивым состоянием, он может быть ограничен в определении временного порядка событий на клеточном уровне и плохо оснащен для оценки преходящего характера динамических процессов, включая митотической прогрессии. В отличие от этого, живая клеточная визуализация является красноречивым инструментом, который может быть использован для наблюдения за клеточными процессами на одноклеточном уровне с течением времени и имеет способность фиксировать динамику процессов, которые в противном случае были бы плохо представлены в визуализации с фиксированными клетками. Здесь мы описываем подход к генерации клеток, несущих флуоресцентно помеченные маркеры хроматина и микротрубочек и их использование в живых клеточных подходах к визуализации для мониторинга выравнивания метафазной хромосомы и митотической выхода. Мы описываем методы, основанные на визуализации, для оценки динамики формирования шпинделя и митотического прогрессирования, включая идентификацию клеток на различных стадиях митоза, выявление и отслеживание митотических дефектов, а также анализ динамики шпинделя и митотические клетки судьба после лечения митотические ингибиторы.
Introduction
Анализ фиксированных клеток на основе изображений обычно используется для оценки изменений уровня популяции клеток в ответ на различные возмущения. В сочетании с синхронизацией клеток, а затем сбор и изображение серийных точек времени, такие подходы могут быть использованы, чтобы предложить клеточной последовательности событий. Тем не менее, фиксированная визуализация клеток ограничена тем, что временные отношения подразумеваются для населения и не демонстрируются на уровне отдельных клеток. Таким образом, в то время как фиксированная клеточная визуализация и анализ достаточны для наблюдения за надежными фенотипами и изменениями устойчивого состояния, способность обнаруживать переходные изменения с течением времени и изменения, влияющие только на субпопуляцию клеток, несовершенна. В отличие от этого, живая клеточная визуализация является красноречивым инструментом, который может быть использован для наблюдения за клеточными и субклеточными процессами в одной клетке, или клеточной популяции, с течением времени и без помощи подходов синхронизации, которые сами по себе могут повлиять на клеточное поведение 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Формирование биполярного митоtic шпинделя имеет важное значение для надлежащей сегрегации хромосомы во время деления клеток, в результате чего две генетически идентичные клетки дочери. Дефекты в структуре митотического шпинделя, которые развращает митотическую прогрессию и ставят под угрозу точность сегрегации хромосом, могут привести к катастрофическим делениям клеток и снижению жизнеспособности клеток. По этой причине, митотические яды, которые изменяют образование шпинделя являются перспективными терапии, чтобы ограничить быстрое распространение раковых клеток7,8,9. Тем не менее, фиксированный клеточный анализ структуры шпинделя после добавления митотических ядов ограничен в своей способности оценить динамический процесс формирования шпинделя и не может указывать, являются ли наблюдаемые изменения в структуре шпинделя постоянными или вместо этого преходящий и может быть преодолен, чтобы позволить успешное разделение клеток.
В этом протоколе мы описываем подход к оценке динамики митоза после возмущений шпинделя с помощью визуализации живых клеток. Использование hTERT увековеченных RPE-1 клеточной линии инженерии, чтобы выразить RFP помечены Histone 2B визуализировать хроматин, вместе с EGFP помечены й-тубулин для визуализации микротрубочек, сроки метафазной хромосомы выравнивания, анафазы начала, и в конечном счете судьба митотической клетки оценивается с помощью визуальных сигналов движения хромосомы, уплотнения и ядерной морфологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Временное разрешение, обеспечиваемые замедленной визуализацией, позволяет визуализировать и оценивать последовательные клеточные события в одиночных клетках. Подходы, которые используют клеточной синхронизации с последующим сбором и фиксацией клеток в последовательных временных ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM поддерживается GRFP NSF. ALM поддерживается финансированием из Смит семьи премии за выдающиеся достижения в области биомедицинских исследований.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
