Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.
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Article de méthode
Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle
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Dans cet article
Résumé
Résumé
L'imagerie en accéléré cellulaire en direct est un outil important en biologie cellulaire qui donne un aperçu des processus cellulaires qui pourraient autrement être négligés, mal compris ou mal interprétés par l'analyse des cellules fixes. Bien que l'imagerie et l'analyse des cellules fixes soient robustes et suffisantes pour observer l'état stable cellulaire, elle peut être limitée dans la définition d'un ordre temporel des événements au niveau cellulaire et est mal équipée pour évaluer la nature transitoire des processus dynamiques, y compris progression mitotique. En revanche, l'imagerie cellulaire vivante est un outil éloquent qui peut être utilisé pour observer les processus cellulaires au niveau d'une seule cellule au fil du temps et a la capacité de capturer la dynamique des processus qui seraient autrement mal représentés dans l'imagerie cellulaire fixe. Ici nous décrivons une approche pour produire des cellules portant des marqueurs fluorescents étiquetés de chromatine et de microtubules et leur utilisation dans les approches vivantes d'imagerie de cellules pour surveiller l'alignement de chromosome de métaphase et la sortie mitotique. Nous décrivons des techniques basées sur l'imagerie pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique, y compris l'identification des cellules à divers stades de la mitose, l'identification et le suivi des défauts mitotiques, et l'analyse de la dynamique du fuseau et destin de cellule mitotique suivant le traitement avec des inhibiteurs mitotic.
Introduction
L'analyse basée sur l'image des cellules fixes est couramment utilisée pour évaluer les changements de niveau de population cellulaire en réponse à diverses perturbations. Lorsqu'elles sont combinées avec la synchronisation cellulaire, suivie par la collecte et l'imagerie des points de temps de série, ces approches peuvent être utilisées pour suggérer une séquence cellulaire des événements. Néanmoins, l'imagerie cellulaire fixe est limitée en ce que les relations temporelles sont implicites pour une population et non démontrées au niveau des cellules individuelles. De cette façon, alors que l'imagerie et l'analyse des cellules fixes sont suffisantes pour observer des ....
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Protocole
1. Génération de cellules hTERT-RPE-1 exprimant de façon stable la DP-Histone 2B (RFP-H2B) et le 'tubulin-EGFP'(tub-EGFP)
REMARQUE : Toutes les étapes suivent des techniques aseptiques et se déroulent dans un coffret de sécurité de niveau de biosécurité II (BSL2MD).
- Générer le rétrovirus porteur des gènes d'intérêt (-tubulin-EGFP et RFP-H2B) par la transfection des cellules 293T avec les plasmides lentiviraux appropriés selon les instructions du fabricant du système de transfection à base de lipides.
- Jour 1 : Utilisez une pipette Pasteur en verre jetable pour aspirer le milieu de culture cellulaire à partir d'une plaque de....
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Résultats
Évaluation de la progression mitotique en présence de perturbations de fuseau
La régulation de la mise au point du pôle de fuseau est une étape essentielle dans la formation bipolaire appropriée de fuseau. Perturbation dans ce processus par des épuisements de protéine, inhibition de drogue, ou des changements dans la structure corrompue de fuseau de nombre centrosome et retardent ou arrêtent la progression mitotique10,
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Discussion
La résolution temporelle fournie par l'imagerie en time-lapse permet la visualisation et l'évaluation des événements cellulaires séquentiels dans les cellules individuelles. Les approches qui font usage de la synchronisation cellulaire suivie de la collecte et de la fixation des cellules aux points de temps séquentiels sont limitées en ce sens que les comparaisons sont finalement faites entre les populations de cellules. Dans les contextes où la réponse cellulaire aux perturbations peut être non uniforme, ou où le proces.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
DLM est soutenu par un GRFP NSF. ALM bénéficie d'un financement du Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsine | Gibo-Life sciences | 25-510 | Une protéase à sérine utilisée pour libérer les cellules adhérentes des boîtes de culture |
| Tubes à centrifuger de 15 ml | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Objectif fluor ; | Nikon | Pour l’imagerie de cellules vivantes pour visualiser à la fois le fond clair et la fluorescence | |
| Cellules 293T | ATCC | CRL-3216 | Pour une utilisation dans la transfection rétrovirale ; utilisé à l’étape 1.1 |
| a-tubuline-EGFP ; | Addgene | divers nombres | Vecteur d’expression de la tubuline alpha fusionnée à une étiquette de protéine fluorescente verte ; pour utilisation dans la visualisation de la tubuline dans l’imagerie de cellules vivantes : disponible dans le commerce auprès d’addgene et d’autres fournisseurs |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Inhibiteur de la kinase mitotique Aurora A. La concentration de stock est préparée à 10 mM dans le DMSO et utilisée à une concentration finale de 100 nM. |
| Blasticidine | Invitrogen | A11139-03 | Agent de sélection d’antibiotiques ; utilisé pour sélectionner les cellules exprimant A-tub-EGFP |
| C02 | Airgas | Pour une utilisation dans la culture cellulaire et l’imagerie de cellules vivantes | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Jeu de filtres monobande ; longueur d’onde d’excitation 545 nm avec une bande passante de 25 nm et émission à une longueur d’onde de 605 nm avec une largeur de bande de 70 nm ; pour la visualisation de H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Jeu de filtres monobande ; longueur d’onde d’excitation 470nm avec bande passante 40nm et émission à 525nm longueur d’onde avec bande passante 50nm ; pour la visualisation de |
| pipettes Pastuer en verre jetables GFP-tubuline, stérilisées ; | Fisher Scientific | 13-678-6A | Pour une utilisation dans les cellules d’aspiration ; |
| Dulbecco' s Milieu Eagle modifié (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Milieu de culture cellulaire pour la croissance des cellules RPE-1 et 293T |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Supplément de milieu de culture cellulaire |
| Lipofectamine 3000 et p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Réactif de transfection à base de lipides pour la transfection de plasmides ; utilisé dans 1.1.4 |
| Boîtes de culture tissulaire multipuits | Corning | divers | pour une utilisation dans la culture cellulaire, la transfection/infection et l’imagerie de cellules vivantes |
| Microscope Nikon Ti-E | Microscope à épifluorescence inversée Nikon pour une utilisation dans l’imagerie de cellules vivantes | ||
| Nikon | Version 4.51 | Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images ; utilisé dans les sections 3 et 4 | |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Milieu sérique réduit pour la transfection cellulaire ; utilisé à l’étape 1.1.3 |
| Pénicilline/Streptomycine ; | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotique utilisé dans le milieu de culture cellulaire |
| solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | solution saline stérile pour utilisation avec la culture cellulaire |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Construction d’expression de l’enveloppe lentivirale VSV-G ; utilisé à l’étape 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Polymère cationique utilisé pour améliorer l’efficacité de l’infection virale ; utilisé à l’étape 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | Plasmide d’emballage lentiviral de 2e génération ; utilisé à l’étape 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Agent de sélection d’antibiotiques ; utilisé pour sélectionner les cellules exprimant RFP-H2B |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | divers numéros | Vecteur d’expression de l’histone 2B marquée à une protéine fluorescente rouge ; pour une utilisation dans la visualisation de la chromatine dans l’imagerie de cellules vivantes : disponible dans le commerce auprès d’Addgene et d’autres fournisseurs |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Réactif de transfection à base de lipides pour la transfection de structures d’ARNi |
| Cellules RPE-1 | ATCC | CRL-4000 | Lignée cellulaire épithéliale de pigment rétinien humain |
| Boîte de culture tissulaire 100x20mm | Corning ; | 353003 | pour une utilisation dans la culture de cellules adhérentes |
| Zyla sCMOS camera ; | Nikon | fixé au microscope, utilisé pour capturer des images de cellules |
Références
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochor....
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Réimpressions et autorisations
