التصوير بالخلايا الحية لتقييم ديناميات توقيت الطور ومصير الخلية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك
Summary
هنا نقدم بروتوكول لتقييم ديناميات تشكيل المغزل والتقدم الميتومي. لدينا تطبيق التصوير الفاصل الزمني تمكن المستخدم من تحديد الخلايا في مراحل مختلفة من المنوّد، وتتبع وتحديد العيوب الميتوتيكية، وتحليل ديناميات المغزل ومصير الخلية الميتومية عند التعرض للأدوية المضادة للميثوتيك.
Abstract
التصوير الحي بالفاصل الزمني للخلايا هو أداة هامة في بيولوجيا الخلايا التي توفر نظرة ثاقبة في العمليات الخلوية التي قد يتم تجاهلها أو إساءة فهمها أو إساءة تفسيرها من خلال تحليل الخلايا الثابتة. في حين أن التصوير والتحليل في الخلايا الثابتة قويويكفي لمراقبة الحالة الخلوية الثابتة، إلا أنه يمكن أن يكون محدوداً في تحديد ترتيب زمني للأحداث على المستوى الخلوي وغير مجهز لتقييم الطبيعة العابرة للعمليات الديناميكية بما في ذلك التقدم الميتومي. وعلى النقيض من ذلك، فإن التصوير بالخلايا الحية هو أداة بليغة يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الخلوية على مستوى الخلية الواحدة مع مرور الوقت، ولديه القدرة على التقاط ديناميات العمليات التي لولا ذلك لكانت ممثلة تمثيلاً ضعيفاً في تصوير الخلايا الثابتة. هنا نقوم بوصف نهج لتوليد الخلايا التي تحمل علامات الفلورسنت المسمى من الكروماتين والأنابيب الدقيقة واستخدامها في نهج التصوير بالخلايا الحية لرصد محاذاة الكروموسوم المرحلة الفوقية والخروج الميتوتيك. نحن نصف التقنيات القائمة على التصوير لتقييم ديناميات تشكيل المغزل والتقدم الميتومي، بما في ذلك تحديد الخلايا في مراحل مختلفة في المنوّج، وتحديد وتتبع العيوب الليتوتيكية، وتحليل ديناميات المغزل و مصير الخلية المصوّلة بعد العلاج مع مثبطات ميتوتيك.
Introduction
ويشيع استخدام التحليل القائم على الصورة للخلايا الثابتة لتقييم التغيرات في مستوى سكان الخلايا استجابة لمختلف الاضطرابات. عند دمجها مع مزامنة الخلايا، متبوعة بجمع وتصوير نقاط الوقت التسلسلية، يمكن استخدام هذه الأساليب لاقتراح تسلسل خلوي للأحداث. ومع ذلك، فإن التصوير بالخلايا الثابتة محدود من حيث أن العلاقات الزمنية ضمنية للسكان ولا تظهر على مستوى الخلايا الفردية. وبهذه الطريقة، في حين أن تصوير الخلايا الثابتة وتحليلها يكفيان لمراقبة الأنماط الظاهرية القوية والتغيرات في الحالة الثابتة، فإن القدرة على الكشف عن التغيرات العابرة مع مرور الوقت والتغيرات التي تؤثر فقط على مجموعة فرعية من الخلايا غير كاملة. وعلى النقيض من ذلك، فإن التصوير بالخلايا الحية هو أداة بليغة يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الخلوية ودون الخلوية داخل خلية واحدة، أو السكان الخلويين، مع مرور الوقت ودون مساعدة من نهج التزامن التي قد تؤثر في حد ذاتها على السلوك الخلوي 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
تشكيل المغزل الميتومي ثنائي القطب ضروري للفصل الكروموسومي السليم أثناء انقسام الخلايا، مما أدى إلى خليتين ابنة متطابقة وراثيا. العيوب في بنية المغزل الميتومية التي تؤدي إلى تلف التقدم الميتومي واختراق دقة فصل الكروموسوم يمكن أن تؤدي إلى انقسامات الخلايا الكارثية وانخفاض قدرة الخلايا على البقاء. لهذا السبب، السموم الميتوتيكية التي تغير تشكيل المغزل هي العلاجات الواعدة للحد من الانتشار السريع للخلايا السرطانية7،8،9. ومع ذلك، فإن تحليل الخلايا الثابتة لهيكل المغزل بعد إضافة السموم الميتوتيكية محدود في قدرته على تقييم العملية الديناميكية لتكوين المغزل وقد لا يشير إلى ما إذا كانت التغيرات الملاحظة في بنية المغزل دائمة أو هي بدلا من ذلك عابرة ويمكن التغلب عليها للسماح تقسيم الخلايا الناجحة.
في هذا البروتوكول، نقوم بوصف نهج لتقييم ديناميات الميثوس بعد اضطرابات المغزل عن طريق التصوير بالخلايا الحية. باستخدام خط الخلية RPE-1 الخالدة hTERT هندستها للتعبير عن الهستون 2B ذات العلامات RFP لتصور الكروماتين، جنبا إلى جنب مع EGFP الموسومة α-tubulin لتصور microtubules، وتوقيت محاذاة الكروموسوم metaphase، بداية الطور، وفي نهاية المطاف يتم تقييم مصير الخلية المصوّلة باستخدام الإشارات البصرية لحركة الكروموسوم، والضغط، والمورفولوجيا النووية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح الدقة الزمنية التي يوفرها التصوير بالفاصل الزمني بتصور وتقييم الأحداث الخلوية المتسلسلة داخل الخلايا المفردة. والنهج التي تستخدم التزامن الخلوي متبوعاً بجمع الخلايا وتثبيتها في نقاط زمنية متسلسلة محدودة من حيث أن المقارنات تتم في نهاية المطاف بين مجموعات الخلايا. في السياقات التي …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم DLM من قبل GRFP NSF. يتم دعم ALM بتمويل من جائزة عائلة سميث للتميز في البحوث الطبية الحيوية.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
