Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle
Summary
Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l’imagerie en time-lapse permet à l’utilisateur d’identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d’identifier les défauts mitotiques, et d’analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l’exposition à des médicaments anti-mitotiques.
Abstract
L’imagerie en accéléré cellulaire en direct est un outil important en biologie cellulaire qui donne un aperçu des processus cellulaires qui pourraient autrement être négligés, mal compris ou mal interprétés par l’analyse des cellules fixes. Bien que l’imagerie et l’analyse des cellules fixes soient robustes et suffisantes pour observer l’état stable cellulaire, elle peut être limitée dans la définition d’un ordre temporel des événements au niveau cellulaire et est mal équipée pour évaluer la nature transitoire des processus dynamiques, y compris progression mitotique. En revanche, l’imagerie cellulaire vivante est un outil éloquent qui peut être utilisé pour observer les processus cellulaires au niveau d’une seule cellule au fil du temps et a la capacité de capturer la dynamique des processus qui seraient autrement mal représentés dans l’imagerie cellulaire fixe. Ici nous décrivons une approche pour produire des cellules portant des marqueurs fluorescents étiquetés de chromatine et de microtubules et leur utilisation dans les approches vivantes d’imagerie de cellules pour surveiller l’alignement de chromosome de métaphase et la sortie mitotique. Nous décrivons des techniques basées sur l’imagerie pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique, y compris l’identification des cellules à divers stades de la mitose, l’identification et le suivi des défauts mitotiques, et l’analyse de la dynamique du fuseau et destin de cellule mitotique suivant le traitement avec des inhibiteurs mitotic.
Introduction
L’analyse basée sur l’image des cellules fixes est couramment utilisée pour évaluer les changements de niveau de population cellulaire en réponse à diverses perturbations. Lorsqu’elles sont combinées avec la synchronisation cellulaire, suivie par la collecte et l’imagerie des points de temps de série, ces approches peuvent être utilisées pour suggérer une séquence cellulaire des événements. Néanmoins, l’imagerie cellulaire fixe est limitée en ce que les relations temporelles sont implicites pour une population et non démontrées au niveau des cellules individuelles. De cette façon, alors que l’imagerie et l’analyse des cellules fixes sont suffisantes pour observer des phénotypes robustes et des changements d’état stable, la capacité de détecter les changements transitoires au fil du temps et les changements qui n’ont d’impact qu’une sous-population des cellules est imparfaite. En revanche, l’imagerie cellulaire vivante est un outil éloquent qui peut être utilisé pour observer les processus cellulaires et subcellulaires au sein d’une seule cellule, ou population cellulaire, au fil du temps et sans l’aide d’approches de synchronisation qui peuvent eux-mêmes avoir un impact sur le comportement cellulaire 1 Fois , 2 (en) , 3 (en) , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6.
La formation d’un fuseau mitotique bipolaire est essentielle pour la ségrégation appropriée de chromosome pendant la division cellulaire, ayant pour résultat deux cellules de fille génétiquement identiques. Les défauts dans la structure mitotique de fuseau qui corrompent la progression mitotique et compromettent la fidélité de la ségrégation de chromosome peuvent avoir comme conséquence des divisions cellulaires catastrophiques et la viabilité réduite de cellules. Pour cette raison, les poisons mitotiques qui modifient la formation de fuseau sont des thérapies prometteuses pour limiter la prolifération rapide des cellules cancéreuses7,8,9. Néanmoins, l’analyse cellulaire fixe de la structure du fuseau à la suite de l’ajout de poisons mitotiques est limitée dans sa capacité à évaluer le processus dynamique de formation du fuseau et peut ne pas indiquer si les changements observés dans la structure du fuseau sont permanents ou sont au lieu transitoire et peut être surmonté pour permettre la division cellulaire réussie.
Dans ce protocole, nous décrivons une approche pour évaluer la dynamique de la mitose suivant des perturbations de fuseau par la formation image de cellules vivantes. Utilisation de la lignée cellulaire RPE-1 immortalisée par hTERT conçue pour exprimer un Histone 2B marqué par la DP pour visualiser la chromatine, ainsi qu’une tubuline étiquetée EGFP pour visualiser les microtubules, le moment de l’alignement des chromosomes métaphase, l’enclenchée et, en fin de compte, Le destin de cellule mitotique sont évalués utilisant des indices visuels du mouvement de chromosome, du compactage, et de la morphologie nucléaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La résolution temporelle fournie par l’imagerie en time-lapse permet la visualisation et l’évaluation des événements cellulaires séquentiels dans les cellules individuelles. Les approches qui font usage de la synchronisation cellulaire suivie de la collecte et de la fixation des cellules aux points de temps séquentiels sont limitées en ce sens que les comparaisons sont finalement faites entre les populations de cellules. Dans les contextes où la réponse cellulaire aux perturbations peut être non uniforme, ou o?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM est soutenu par un GRFP NSF. ALM bénéficie d’un financement du Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
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