Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático
Summary
Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.
Abstract
Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas son una herramienta importante en la biología celular que proporciona información sobre los procesos celulares que de otro modo podrían ser pasados por alto, malinterpretados o malinterpretados por el análisis de células fijas. Si bien la imagen y el análisis de células fijas son robustos y suficientes para observar el estado estacionario celular, puede ser limitado en la definición de un orden temporal de eventos a nivel celular y está mal equipado para evaluar la naturaleza transitoria de los procesos dinámicos, incluyendo progresión mitotica. Por el contrario, la imagen celular viva es una herramienta elocuente que se puede utilizar para observar procesos celulares a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo y tiene la capacidad de capturar la dinámica de procesos que de otro modo estarían mal representados en las imágenes de células fijas. Aquí describimos un enfoque para generar células que llevan marcadores etiquetados fluorescentesmente de cromatina y microtúbulos y su uso en enfoques de imágenes de células vivas para monitorear la alineación del cromosoma metafásico y la salida mitótica. Describimos técnicas basadas en imágenes para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitológica, incluida la identificación de células en varias etapas de la mitosis, la identificación y el seguimiento de defectos mitoticos, y el análisis de la dinámica del husillo y destino de células mitoticas tras el tratamiento con inhibidores mitoticos.
Introduction
El análisis basado en imágenes de células fijas se utiliza comúnmente para evaluar los cambios en el nivel de población celular en respuesta a diversas perturbaciones. Cuando se combina con la sincronización celular, seguida de la recopilación y la creación de imágenes de puntos de tiempo en serie, estos enfoques se pueden utilizar para sugerir una secuencia celular de eventos. Sin embargo, las imágenes de células fijas están limitadas en el sin embargo, las relaciones temporales están implícitas para una población y no se demuestran a nivel de celdas individuales. De esta manera, mientras que la creación de imágenes y análisis de células fijas es suficiente para observar fenotipos robustos y cambios en el estado estacionario, la capacidad de detectar cambios transitorios a lo largo del tiempo y cambios que afectan solo a una subpoblación de las células es imperfecta. Por el contrario, la imagen celular viva es una herramienta elocuente que se puede utilizar para observar procesos celulares y subcelulares dentro de una sola célula, o población celular, con el tiempo y sin la ayuda de enfoques de sincronización que pueden afectar el comportamiento celular 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
La formación de un husillo mitético bipolar es esencial para la segregación cromosómica adecuada durante la división celular, lo que resulta en dos células hijas genéticamente idénticas. Los defectos en la estructura del husillo mitotico que corrompen la progresión mitotica y comprometen la fidelidad de la segregación cromosómica pueden resultar en divisiones celulares catastróficas y una menor viabilidad celular. Por esta razón, los venenos mitoticos que alteran la formación del husillo son terapias prometedoras para limitar la rápida proliferación de células cancerosas7,8,9. Sin embargo, el análisis de células fijas de la estructura del husillo después de la adición de venenos mitoticos es limitado en su capacidad para evaluar el proceso dinámico de formación del husillo y puede no indicar si los cambios observados en la estructura del husillo son permanentes o son en cambio transitorio y puede ser superado para permitir una división celular exitosa.
En este protocolo, describimos un enfoque para evaluar la dinámica de la mitosis después de las perturbaciones del husillo por imágenes de células vivas. Usando la línea celular RPE-1 inmortalizada hTERT diseñada para expresar un Histone 2B con la etiqueta RFP para visualizar la cromatina, junto con una tubulina con etiqueta EGFP para visualizar microtúbulos, el tiempo de alineación del cromosoma metafase, el inicio de la anafase y, en última instancia, el destino celular mitotico se evalúa mediante señales visuales de movimiento cromosómico, compactación y morfología nuclear.
Protocol
Representative Results
Discussion
La resolución temporal proporcionada por las imágenes de lapso de tiempo permite la visualización y evaluación de eventos celulares secuenciales dentro de células individuales. Los enfoques que hacen uso de la sincronización celular seguido de la recopilación y fijación de celdas en puntos de tiempo secuenciales son limitados en que las comparaciones se hacen en última instancia entre poblaciones de celdas. En contextos donde la respuesta celular a las perturbaciones puede ser no uniforme, o donde el proceso que…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM es compatible con un NSF GRFP. ALM cuenta con el apoyo del Premio Smith Family a la Excelencia en Investigación Biomédica.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
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