Affichage bactérien de Peptide pour la sélection des enzymes de biotinylating de roman
Summary
Ici, nous présentons une méthode pour sélectionner pour de nouvelles variantes de la bitine-protéine E. coli ligase BirA qui biotinylates un peptide cible spécifique. Le protocole décrit la construction d’un plasmide pour l’affichage bactérien du peptide cible, la génération d’une bibliothèque BirA, la sélection et la caractérisation des variantes de BirA.
Abstract
La biotine est une modification post-traductionnelle attrayante des protéines qui fournit une étiquette puissante pour l’isolement et la détection des protéines. La biotinylation enzymatique par la ligase de biotine-protéine E. coli BirA est très spécifique et permet la biotinylation des protéines cibles dans leur environnement indigène ; cependant, l’utilisation actuelle de la biotinylation médiée par BirA nécessite la présence d’un peptide accepteur synthétique (AP) dans la protéine cible. Par conséquent, son application est limitée aux protéines qui ont été conçues pour contenir l’AP. Le but du protocole actuel est d’utiliser l’affichage bactérien d’un peptide dérivé d’une protéine cible non modifiée pour sélectionner pour les variantes de BirA qui biotinylates le peptide. Le système est basé sur un plasmide unique qui permet la co-expression des variantes BirA avec un échafaudage pour l’affichage peptide sur la surface bactérienne. Le protocole décrit une procédure détaillée pour l’incorporation du peptide cible dans l’échafaudage d’affichage, la création de la bibliothèque BirA, la sélection des variantes actives de BirA et la caractérisation initiale des variantes isolées de BirA. La méthode fournit un système de sélection très efficace pour l’isolement de nouvelles variantes BirA qui peuvent être utilisés pour l’évolution dirigée des ligases biotine-protéines qui biotinylate une protéine indigène dans des solutions complexes.
Introduction
La biotinylation d’une protéine crée une étiquette puissante pour son isolement et sa détection d’affinité. La biotinylation des protéines enzymatiques est une modification post-traduction très spécifique catalysée par des ligases biotine-protéines. La ligase de biotine-protéine E. coli BirA est extrêmement spécifique et ne biotinylates covalently qu’un nombre restreint de protéines naturelles à des résidus spécifiques de lysine1. Les avantages de la biotinylation catalysée De BirA sont actuellement exploités en fusionnant la protéine cible avec un petit peptide synthétique de biotine de biotine à 15 amino-acides (AP) qui est effectivement biotinylated2 et permet le très spécifique et biotinylation efficace in vivo et in vitro par co-expression ou ajout de BirA3,4,5. Bien que la ligature biotine-protéine catalysée in vivo et in vitro de BirA soit une stratégie d’étiquetage attrayante, son application se limite aux échantillons qui contiennent des protéines fusionnées par ap. Le but de cette méthode est le développement de nouveaux mutants de ligases biotine-protéine qui biotinylate sélectivement protéines indigènes non modifiées et, ce faisant, augmenter le nombre d’applications dans lesquelles la stratégie de biotinylation enzymatique peut être utilisé.
La fonction protéique peut être évoluée par des cycles itératifs de la mutation, de la sélection et de l’amplification des variantes génétiques avec la fonction désirée. Une stratégie de sélection forte et efficace est cruciale pour l’évolution dirigée et l’activité de ligase biotine-protéine est facilement sélectionnée en raison de la forte liaison entre la biotine et la streptavidine et ses homologs6. Les technologies d’affichage des phages permettent la sélection de phages qui présentent des peptides biotinylated7,8. Puisque l’amplification des phages isolés exige l’infection d’un hôte bactérien, cependant, la sélection de phage avec la streptavidine crée un goulot d’étranglement en ce que la liaison à haute affinité de la biotine à la streptavidine est pratiquement irréversible sous non-dénaturation Conditions. Pour assurer la liaison réversible des phages biotinylated, les avidins monomeric avec l’affinité inférieure ont été employés qui ont eu comme conséquence un modeste enrichissement de 10 fois7. Nous avons récemment développé une méthode d’affichage bactérien pour l’isolement des nouvelles variantes BirA qui élimine la nécessité de l’élution de la matrice d’affinité et élimine ainsi un goulot d’étranglement des systèmes de sélection BirA précédents9. En effet, notre système d’affichage bactérien permet un enrichissement de clones actifs en une seule étape de sélection9,offrant ainsi un système de sélection efficace pour l’évolution dirigée de nouvelles variantes de BirA.
Notre système d’affichage bactérien se compose de deux composants, BirA avec une étiquette C-terminal 6xHis et une protéine d’échafaudage qui permet l’affichage de surface d’un peptide cible. Nous avons utilisé la protéine d’échafaudage augmentée circulairement permutée protéine de membrane externe X (eCPX) puisque l’affichage efficace des peptides peut être observé à la fois à la N- et C-termini10,11. La fusion de la séquence de peptide cible au terminus C de l’eCPX assure la biotinylation des bactéries exprimant des variantes actives de BirA. Les bactéries permettent la sélection efficace de streptavidin que le peptide biotinylated affiche maintenant sur la surface (figure 1a).
Le but de cette méthode est de sélectionner pour de nouvelles variantes de BirA qui biotinylates séquences peptidiques présentes dans les protéines indigènes. Le système est encodé par des gènes présents sur le plasmique pBAD-BirA-eCPX-AP, qui contient un promoteur arabinose-inductible contrôlant BirA (araBAD), et un promoteur T7 contrôlant eCPX9 (Figure 1b). Le protocole actuel décrit la procédure détaillée pour 1) l’incorporation d’un peptide dérivé d’une protéine cible dans le C-terminal d’eCPX, 2) la création d’une bibliothèque mutationnelle de BirA par PCR sujette aux erreurs, 3) sélection de bactéries liant la streptavidine par tri cellulaire activé magnétique (MACS), 4) quantification de l’enrichissement des bactéries et 5) caractérisation initiale des clones isolés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme pour toutes les méthodes de sélection, la rigueur des étapes de lavage est de la plus haute importance. Étant donné que les bactéries n’ont pas besoin d’être élifiées des perles avant l’amplification des clones sélectionnés, la liaison à forte affinité entre la biotine et la streptavidine peut être utilisée au lieu d’utiliser des avidins à faible affinité, comme cela a déjà été fait avec le système d’affichage des phages, pour la sélection des variantes BirA7,</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mohamed Abdullahi Ahmed pour l’assistance d’un technicien expert. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Lundbeck, de la Fondation Novo Nordisk, de l’Association danoise du rein, de la Fondation Aase og Ejnar Danielsen, de la Fondation A.P. M’ller pour l’avancement des sciences médicales, et de Knud et Edith Eriksen. Fondation Memorial.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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