कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में एक्स्ट्रासेलुलर पीएच की निगरानी
Summary
प्रोटोकॉल कैंडिडा एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन से मिलकर क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती का वर्णन करता है और इन बायोफिल्म्स के अंदर एक्स्सेल्युलर पीएच की निगरानी के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
फंगल और बैक्टीरियल कोशिकाओं दोनों से मिलकर क्रॉस-किंगडम बायोफिल्मएं विभिन्न प्रकार की मौखिक बीमारियों में शामिल होती हैं, जैसे एंडोडोटिक संक्रमण, पीरियोडोंटाइटिस, म्यूकोसल संक्रमण और, सबसे विशेष रूप से, बचपन की मिर्च। इन सभी स्थितियों में, बायोफिल्म मैट्रिक्स में पीएच माइक्रोब-होस्ट इंटरैक्शन को प्रभावित करता है और इस प्रकार रोग प्रगति करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में कैंडिडा एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन शामिल क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स के अंदर पीएच गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी-आधारित विधि का वर्णन किया गया है। पीएच-निर्भर दोहरे उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और रेशियोमेट्रिक जांच सी-SNARF-4 के धुंधला गुणों का शोषण बायोफिल्मों के बाह्य क्षेत्रों में पीएच में बूंदों का निर्धारण करने के लिए किया जाता है। जांच के साथ पीएच रेशियोमेट्री के उपयोग के लिए इमेजिंग पैरामीटर, रंग का पूरी तरह से अंशांकन, और छवि डेटा के सावधानीपूर्वक, सीमा आधारित पोस्ट-प्रोसेसिंग की आवश्यकता होती है। जब सही ढंग से उपयोग किया जाता है, तो तकनीक बायोफिल्म के विभिन्न क्षेत्रों में बाह्य पीएच के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है और इस प्रकार समय के साथ क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ग्रेडिएंट दोनों की निगरानी करती है। जबकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग जेड-प्रोफाइलिंग को 75 माइक्रोन या उससे कम की पतली बायोफिल्मों तक सीमित करता है, पीएच रेशियोमेट्री का उपयोग आदर्श रूप से क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में एक महत्वपूर्ण उग्रता कारक के नॉनइनवेसिव अध्ययन के लिए अनुकूल है।
Introduction
फंगल और बैक्टीरियल दोनों प्रजातियों को शामिल क्रॉस-किंगडम बायोफिल्ममौखिक गुहा में कई पैथिक स्थितियों में शामिल हैं। कैंडिडा spp. अक्सर एंडोडोन्टिक संक्रमण1 से अलग किया गया है और पीरियोडोन्टल घावों2,3से । म्यूकोसल संक्रमणों में, मिटिस समूह से स्ट्रेप्टोकोकल प्रजातियों को इन विट्रो और म्यूरन मॉडल4,5,6,7दोनों में फंगल बायोफिल्म गठन, ऊतक आक्रमण और प्रसार को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। सबसे दिलचस्प बात यह है कि कैंडिडा पीपी की मौखिक गाड़ी8बच्चों में क्षरण की व्यापकता से जुड़ी हुई साबित हुई है । जैसा कि कृंतक मॉडलों में दिखाया गया है, स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन और कैंडिडास एल्बिकान के बीच एक सहजीवी संबंध एक्स्ट्रासेलुलर पॉलीसैकराइड्स के उत्पादन को बढ़ाता है और मोटा और अधिक कैरिओजेनिक बायोफिल्म्स9,10के गठन की ओर जाता है।
उपर्युक्त सभी स्थितियों में, विशेष रूप से प्रारंभिक बाल्यावस्था क्षरण, रोग प्रगति के लिए बायोफिल्म पीएच का महत्व है, और एसिडोजेनिक माइक्रोवातावरण के विकास के लिए बायोफिल्म मैट्रिक्स की प्रख्यात भूमिका11 उन पद्धतियों के लिए कॉल करती है जो क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स के अंदर पीएच परिवर्तन का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। बैक्टीरियल12 और फंगल13 बायोफिल्म्स के अंदर पीएच की निगरानी के लिए सरल और सटीक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। रेशियोमेट्रिक डाइ सी-SNARF-4 और दहलीज आधारित छवि पोस्ट प्रसंस्करण के साथ, एक्स्ट्रासेलुलर पीएच एक बायोफिल्म14के सभी तीन आयामों में वास्तविक समय में निर्धारित किया जा सकता है । बायोफिल्म्स में माइक्रोस्कोपी आधारित पीएच-मॉनिटरिंग के लिए अन्य प्रकाशित तकनीकों की तुलना में, सी-SNARF-4 के साथ पीएच रेशियोमेट्री सरल और सस्ता है, क्योंकि इसमें कणों या यौगिकों के संश्लेषण की आवश्यकता नहीं होती है जिसमें संदर्भडाइ15 या दो-फोटॉन उत्तेजना16का उपयोग शामिल है। सिर्फ एक रंग का उपयोग जांच के साथ समस्याओं को रोकता है, फ्लोरोसेंट खून के माध्यम से, और चयनात्मक ब्लीचिंग16,17,18 जबकि अभी भी अंतर और बाह्य शिक्की पीएच के बीच एक विश्वसनीय भेदभाव के लिए अनुमति देता है । अंत में, बायोफिल्म विकास के बाद डाइ के साथ ऊष्मायन किया जाता है, जो प्रयोगशाला और सीटू-ग्रोन बायोफिल्म्स दोनों का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
वर्तमान कार्य का उद्देश्य पीएच रेशियोमेट्री के उपयोग का विस्तार करना और क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में पीएच परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करना है। अवधारणा के सबूत के रूप में, विधि का उपयोग दोहरी प्रजातियों की जैव फिल्मों में पीएच की निगरानी के लिए किया जाता है जिसमें एस म्यूटन और सी एल्बिकान होते हैं जो ग्लूकोज के संपर्क में होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सी एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपी से जुड़ी क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल पहले9,22,23,24,25वर्णित किए गए ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anette Aakjær थॉमसन और जेवियर ई. गार्सिया उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं । लेखक छवि विश्लेषण पर उपयोगी चर्चाके लिए रूबेन्स स्पिन-नेटो का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
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