Consegna intratecala di Oligonucleotidi Antisense nel Rat Central Nervous System
Summary
Qui, descriviamo un metodo per fornire farmaci al sistema nervoso centrale del ratto impiantando un catetere nello spazio lombare intrateco della colonna vertebrale. Ci concentriamo sulla consegna di oligonucleotidi antisenso, anche se questo metodo è adatto per la consegna di altre modalità terapeutiche pure.
Abstract
La barriera ematoencefalica (BBB) è un’importante difesa contro l’ingresso di agenti potenzialmente tossici o patogeni dal sangue al sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, la sua esistenza riduce drasticamente anche l’accessibilità di agenti terapeutici amministrati sistemicamente al SNC. Un metodo per superare questo, è quello di iniettare tali agenti direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF), bypassando così il BBB. Questo può essere fatto tramite l’impianto di un catetere per l’infusione continua utilizzando una pompa osmotica, o per la consegna di un singolo bolus. In questo articolo, descriviamo un protocollo chirurgico per la consegna di oligonucleotidi antisenso (AsO) mirati al SNC tramite un catetere impiantato direttamente nello spazio cauda equina della colonna vertebrale del ratto adulto. Come risultati rappresentativi, mostriamo l’efficacia di una singola iniezione intratecala (IT) di bolus attraverso questo sistema di cateterizzazione nell’abbattere l’RNA bersaglio in diverse regioni del ratto CNS. La procedura è sicura, efficace e non richiede attrezzature costose o strumenti chirurgici. La tecnica qui descritta può essere adattata per fornire farmaci anche in altre modalità.
Introduction
Il sistema vascolare del sistema nervoso centrale (SNC) si è evoluto come regolatore critico dell’omeostasi, controllando il traffico di molecole, fornendo nutrienti e eliminando i rifiuti. Questo sistema è anche la prima linea di difesa dagli attacchi di agenti patogeni esterni, grazie ad una distribuzione densa di giunzioni strette lungo le pareti delle cellule endoteliali. Queste giunzioni strette costituiscono un aspetto della barriera ematoencefalica (BBB). Mentre il BBB consente il trasporto di molecole necessarie per soddisfare la domanda di nutrienti ed energia (ad esempio, ioni, glucosio), limita anche selettivamente il passaggio di agenti patogeni e sostanze chimiche tossiche1,2,3.
Ironia della sorte, la stessa funzione protettiva della BBB che limita il passaggio di patogeni e sostanze chimiche tossiche è anche il principale ostacolo alla nostra capacità di accedere facilmente al SNC con trattamenti terapeutici dopo la somministrazione sistemica all’organismo2, 4,5. Questo ruolo della BBB ha stimolato lo sviluppo di una pletora di nuove tecnologie di distribuzione di farmaci e si avvicina a6.
Un modo per superare questo ostacolo è quello di iniettare i farmaci direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF) che continuamente perfonde sia il cervello che il midollo spinale7,8,9,10. In questo articolo, descriviamo un metodo per consegnare con successo gli agenti nello spazio lombare intrathecal posizionando l’estremità interna del catetere completamente nello spazio cauda equina della colonna vertebrale del ratto. Una descrizione di questa procedura è stata precedentemente pubblicata da Mazur et al.
Il protocollo è molto efficace e produce un tasso di successo superiore al 90% della consegna di oligonucleotidi antisenso (ASO) al SNC quando valutato dall’analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) del knockdown del gene bersaglio8. La procedura provoca un disagio minimo per gli animali, poiché il 100% dei ratti sopravvive all’intervento e mostra un minimo gonfiore intorno alla ferita chirurgica e nessun segno di disagio (ad esempio, iperattività, disidratazione, circolare, perdita di equilibrio, diminuzione dell’assunzione di cibo e disidratazione) durante l’osservazione post-operatoria. Un altro vantaggio del metodo qui descritto è che non richiede attrezzature costose, né strumenti speciali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente articolo mostra un potente metodo per fornire agenti terapeutici direttamente nel ratto CNS. In teoria, una tecnica simile può essere eseguita anche nei topi, anche se a causa delle dimensioni più piccole, il metodo può essere più impegnativo. Pertanto, il nostro gruppo esegue iniezioni intracerebroventricoculari (ICV) nei topi per la somministrazione di farmaci CNS, che raggiungono gli stessi obiettivi attraverso una diversa via di somministrazione. Tale metodo è stato descritto in un altro studio<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Ionis Pharmaceuticals per la fornitura degli ASO descritti nell’articolo.
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
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