Представлен протокол для обнаружения циркулирующих опухолевых клеток яичников, используя специально сделанную фотоакустическую систему потока и целевые фолиевую кислоту, покрытые наночастицами сульфида меди.
Многие исследования показывают, что перечисление циркулирующих опухолевых клеток (КТК) может показать обещание в качестве прогностиконного инструмента для рака яичников. Текущие стратегии обнаружения КТК включают цитометрию потока, микрофлюидные устройства и цепную реакцию полимеразы в реальном времени (РТ-ПЦР). Несмотря на последние достижения, методы выявления ранних метастазов рака яичников по-прежнему не имеют чувствительности и специфичности, необходимых для клинического перевода. Здесь представлен новый метод обнаружения циркулирующих опухолевых клеток яичников с помощью фотоакустической цитометрии потока (PAFC), используя пользовательскую трехмерную (3D) печатную систему, включая камеру потока и шприц-насос. Этот метод использует фолиевую кислоту крышкой медных сульфидных наночастиц (FA-CuS NPs) для целевой SKOV-3 раковых клеток яичников ПАФК. Эта работа демонстрирует сродство этих контрастных агентов для раковых клеток яичников. Результаты показывают, NP характеристики, PAFC обнаружения, и NP поглощения флуоресценции микроскопии, тем самым демонстрируя потенциал этой новой системы для обнаружения яичников CtCs в физиологически соответствующих концентрациях.
Рак яичников является одним из самых смертоносных гинекологических злокачественных новообразований и привело, по оценкам, 184800 смертей во всем мире в 2018году 1. Многочисленные исследования показали корреляцию между прогрессированием рака яичников (т.е. метастазированием) и наличием КТК2,3,4. Наиболее распространенным методом обнаружения и изоляции CTCs использует систему Cellsearch, которая нацелена на рецептор EpCam5. Выражение EpCam, однако, downregulated в эпителии к мезенхимальному переходу, который был замешан в метастазах рака6. Несмотря на достижения, современные клинические технологии по-прежнему страдают от низкой точности, высокой стоимости и сложности. Из-за этих недостатков, новые технологии для обнаружения и перечисления яичников CTCs стала важной областью для исследований.
Недавно PAFC стала эффективным методом неинвазивного обнаружения раковых клеток, анализа наноматериалов и выявления бактерий7,8,9. PAFC отличается от традиционной цитометрии потока флуоресценции, обнаруживая аналиты в потоке с помощью фотоакустики. Фотоакустический эффект генерируется, когда лазерный свет поглощается материалом, который вызывает термоэластичную экспансию, производя акустическую волну, которая может быть обнаружена ультразвуковым преобразователем10,11. Преимущества PAFC по сравнению с традиционными методами цитометрии потока включают простоту, простоту перевода в клинические условия, и обнаружение CtCs на беспрецедентных глубинах в образцах пациента12,13. Недавние исследования использовали системы PAFC для обнаружения клеток с использованием эндогенного и экзогенного контраста14,15. Ближайшие инфракрасные (NIR) светопоглощающие контрастные вещества, такие как индоцианин зеленый краситель, и металлические NPs (например, золото и CuS) были использованы для селективной маркировки клеток и тканей в сочетании с фотоакустической визуализации16,17,18. Благодаря улучшенной глубине проникновения NIR света в биологических тканях, фотоакустическое обнаружение амортизаторов может быть выполнено на больших глубинах для клинического применения. Из-за своего большого потенциала для использования в клинике, сочетание целевых NIR контрастных агентов с PAFC вызвало значительный интерес для обнаружения КТК.
PAFC в сочетании с целевыми контрастными агентами обеспечивает улучшенный подход к высокопроходимым анализам образцов пациентов с повышенной точностью и целенаправленным обнаружением КТК. Одной из основных стратегий обнаружения КТК является специфическая таргетинг мембранных белков, присутствующих на клетке интереса. Одной из примечательных характеристик КТК яичников является переэкспрессия рецепторов фолиевой кислоты, расположенных на их внешней мембране19. Таргетинг фолиевой рецептор является идеальной стратегией для выявления КТК яичников в крови, потому что эндогенные клетки, которые имеют более высокое выражение рецепторов фолиевой кислоты, как правило, светятся и имеют ограниченное воздействие кровотока20. Медь сульфидНых NPs (CuS NPs) недавно были признаны за их способность целевой фолиевой рецепторов, выраженных на раковых клетках21. В сочетании с их биосовместимостью, простотой синтеза и поглощением глубоко в NIR, эти контрастные агенты NP делают идеальную стратегию таргетинга для обнаружения КТК яичников с использованием PAFC.
Эта работа описывает подготовку FA-CuS NPs и их использование для обнаружения раковых клеток яичников в фотоакустической системе потока. CuS NPs модифицируются с фолиевой кислотой, чтобы специально целевой Яичников CTCs и излучают фотоакустический сигнал, когда стимулируется с 1053 нм лазера. Результаты свидетельствуют об успешном обнаружении раковых клеток яичников, инкубированных с помощью этих фотоакустических контрастных агентов в системе PAFC. Эти результаты показывают обнаружение раковых клеток яичников вплоть до концентрации 1 клетки / Л, и флуоресценция микроскопии подтверждает успешное поглощение этих частиц SKOV-3 раковых клеток яичников22. Эта работа содержит подробное описание синтеза ФА-Кус-НП, подготовки образцов для флуоресценции, построения фотоакустической системы потока, а также фотоакустического обнаружения раковых клеток яичников. Представленный метод показывает успешную идентификацию КТК яичников в потоке с использованием FA-CuS NPs. Будущая работа будет сосредоточена на клиническом применении этой технологии в целях раннего выявления метастазов рака яичников.
Этот протокол является простым методом обнаружения КТК яичников с использованием PAFC и целевого контрастного агента CuS. Многие методы были изучены для обнаружения КТК яичников, в том числе микрофлюидных устройств, RT-PCR, и флуоресценции потока цитометрии23,24</su…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить Мадлен Хауэлл за ее помощь в синтезе, Мэтью Сундук за его помощь в проектировании системы потока, и Итан Маршал за помощь с SolidWorks.
0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
3D Printed Tank | Custom-made | ||
Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |