Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie
Summary
Ein Protokoll wird vorgestellt, um zirkulierende Eierstocktumorzellen unter Verwendung eines maßgeschneiderten photoakustischen Strömungssystems und gezielter Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel zu detektieren.
Abstract
Viele Studien deuten darauf hin, dass die Aufzählung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) als prognostisches Werkzeug für Eierstockkrebs vielversprechend sein könnte. Aktuelle Strategien für den Nachweis von CTCs umfassen Durchflusszytometrie, mikrofluidische Geräte und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Trotz der jüngsten Fortschritte fehlt es den Methoden zur Erkennung von frühen Ovarialkarzinastasen noch immer an der Empfindlichkeit und Spezifität, die für die klinische Übersetzung erforderlich sind. Hier wird eine neuartige Methode zum Nachweis von zellaren zirkulierenden Tumorzellen durch photoakustische Durchflusszytometrie (PAFC) unter Verwendung eines benutzerdefinierten dreidimensionalen (3D) gedruckten Systems, einschließlich einer Durchflusskammer und Spritzenpumpe, vorgestellt. Diese Methode verwendet Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel (FA-CuS NPs), um SKOV-3 Eierstockkrebszellen durch PAFC zu zielen. Diese Arbeit zeigt die Affinität dieser Kontrastmittel für Eierstockkrebszellen. Die Ergebnisse zeigen NP-Charakterisierung, PAFC-Detektion und NP-Aufnahme durch Fluoreszenzmikroskopie und zeigen damit das Potenzial dieses neuartigen Systems, Eierstock-CTCs in physiologisch relevanten Konzentrationen zu detektieren.
Introduction
Eierstockkrebs ist eine der tödlichsten gynäkologischen Erkrankungen und führte 2018 weltweit zu schätzungsweise 184.800 Todesfällen1. Mehrere Studien haben die Korrelation zwischen der Progression von Eierstockkrebs (d. h. Metastasierung) und dem Vorhandensein von CTCs2,3,4gezeigt. Die gängigste Methode zur Detektion und Isolierung von CTCs nutzt das Cellsearch-System, das auf den EpCam-Rezeptor5abzielt. EpCam-Expression ist jedoch im epitheliale bis mesenchymalen Übergang, der in Krebsmetastasen verwickelt ist, downreguliert6. Trotz der Fortschritte leiden die aktuellen klinischen Technologien immer noch unter geringer Genauigkeit, hohen Kosten und Komplexität. Aufgrund dieser Nachteile sind neue Technologien für die Entdeckung und Aufzählung von Eierstock-CTCs zu einem wichtigen Forschungsgebiet geworden.
Kürzlich entwickelte sich PAFC als wirksame Methode zur nichtinvasiven Detektion von Krebszellen, zur Analyse von Nanomaterialien und zur Identifizierung von Bakterien7,8,9. PAFC unterscheidet sich von der herkömmlichen Fluoreszenzflusszytometrie durch die Detektion von Analyten im Fluss durch die Verwendung von Photoakustik. Der photoakustische Effekt wird erzeugt, wenn Laserlicht von einem Material absorbiert wird, das eine thermoelastische Ausdehnung verursacht und eine akustische Welle erzeugt, die von einem Ultraschallwandler10,11erkannt werden kann. Zu den Vorteilen von PAFC gegenüber herkömmlichen Durchflusszytometriemethoden gehören Einfachheit, einfache Übersetzung in klinische Umgebungen und der Nachweis von CTCs in beispiellosen Tiefen in Patientenproben12,13. Neuere Studien haben PAFC-Systeme für den Nachweis von Zellen mit endogenem und exogenem Kontrast14,15verwendet. Nahinfrarot (NIR) lichtabsorbierende Kontrastmittel wie indocyanine grüner Farbstoff und MetallNPs (z.B. Gold und CuS) wurden für die selektive Kennzeichnung von Zellen und Geweben in Kombination mit photoakustischer Bildgebung16,17,18verwendet. Durch die verbesserte Eindringtiefe von NIR-Licht in biologischen Geweben kann die photoakustische Detektion von Absorbern in größeren Tiefen für klinische Anwendungen durchgeführt werden. Aufgrund ihres großen Einsatzpotenzials in der Klinik hat die Kombination von gezielten NIR-Kontrastmitteln mit PAFC großes Interesse für den Nachweis von CTCs geweckt.
PAFC in Kombination mit gezielten Kontrastmitteln bietet einen verbesserten Ansatz für die Analyse von Patientenproben mit hohem Durchsatz mit verbesserter Genauigkeit und gezielter Detektion von CTCs. Eine der wichtigsten Nachweisstrategien für CTCs ist die spezifische Ausrichtung von Membranproteinen, die auf der Zelle von Interesse vorhanden sind. Ein bemerkenswertes Merkmal von Eierstock-CTCs ist die Überexpression von Folatrezeptoren auf ihrer äußeren Membran19. Folatrezeptor-Targeting ist eine ideale Strategie für die Identifizierung von Eierstock-CTCs im Blut, da endogene Zellen, die eine höhere Expression von Folsäurerezeptoren haben, in der Regel luminal sind und eine begrenzte Exposition gegenüber dem Blutkreislauf20haben. Kupfersulfid NPs (CuS NPs) wurden vor kurzem für ihre Fähigkeit, Folat-Rezeptoren auf Krebszellen exprimiert21anerkannt. Kombiniert mit ihrer Biokompatibilität, einfachen Synthese und Absorption tief im NIR, bilden diese NP-Kontrastmittel eine ideale Targeting-Strategie für den Nachweis von Eierstock-CTCs unter Verwendung von PAFC.
Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitung von FA-CuS NPs und deren Verwendung für den Nachweis von Eierstockkrebszellen in einem photoakustischen Strömungssystem. CuS NPs werden mit Folsäure modifiziert, um gezielt Ovarial-CTCs anzusprechen und ein photoakustisches Signal auszusenden, wenn sie mit einem 1.053 nm Laser stimuliert werden. Die Ergebnisse deuten auf den erfolgreichen Nachweis von Eierstockkrebszellen hin, die mit diesen photoakustischen Kontrastmitteln innerhalb des PAFC-Systems inkubiert werden. Diese Ergebnisse zeigen den Nachweis von Eierstockkrebszellen bis hin zu Konzentrationen von 1 Zelle/L, und die Fluoreszenzmikroskopie bestätigt die erfolgreiche Aufnahme dieser Partikel durch SKOV-3 Eierstockkrebszellen22. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der FA-CuS NPs Synthese, die Vorbereitung von Proben für die Fluoreszenzmikroskopie, den Aufbau des photoakustischen Strömungssystems und die photoakustische Detektion von Eierstockkrebszellen. Die vorgestellte Methode zeigt eine erfolgreiche Identifizierung von Eierstock-CTCs im Fluss unter Verwendung von FA-CuS NPs. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die klinische Anwendung dieser Technologie zur Früherkennung von Eierstockkrebsmetastasen konzentrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ist eine einfache Methode zur Erkennung von Eierstock-CTCs unter Verwendung von PAFC und einem gezielten CuS-Kontrastmittel. Viele Methoden wurden für den Nachweis von Eierstock-CTCs erforscht, einschließlich mikrofluidischer Geräte, RT-PCR und Fluoreszenz-Flow-Zytometrie23,24,25. Diese reichen von Komplexität, Kosten und Genauigkeit, wodurch ihre Wirksamkeit in klinischen Umgebungen eingeschränkt wird. PAF…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen Madeleine Howell für ihre Hilfe bei der Synthese, Matthew Chest für seine Hilfe bei der Entwicklung des Strömungssystems und Ethan Marschall für die Unterstützung bei SolidWorks.
Materials
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
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