Un protocole est présenté pour détecter les cellules tumorales ovariennes circulantes à l'aide d'un système de flux photoacoustique sur mesure et de nanoparticules de sulfure de cuivre plaquées à l'acide folique ciblée.
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Article de méthode
Détection du cancer de l'ovaire à l'aide de la cytométrie du flux photoacoustique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Beaucoup d'études suggèrent que l'énumération des cellules de tumeur circulantes (CTC) puisse montrer la promesse comme outil pronostique pour le cancer ovarien. Les stratégies actuelles de détection des CCT comprennent la cytométrie du débit, les dispositifs microfluidiques et la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (RT-PCR). Malgré les progrès récents, les méthodes de détection des métastes précoces du cancer de l'ovaire n'ont toujours pas la sensibilité et la spécificité requises pour la traduction clinique. Ici, une nouvelle méthode est présentée pour la détection des cellules tumorales circulantes ovariennes par cytométrie de flux photoacoustique (PAFC) utilisant un système imprimé tridimensionnel (3D) personnalisé, y compris une chambre d'écoulement et une pompe à seringues. Cette méthode utilise des nanoparticules de sulfure de cuivre à teneur en acide folique (FA-CuS NPs) pour cibler les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-3 par PAFC. Ce travail démontre l'affinité de ces agents de contraste pour les cellules cancéreuses de l'ovaire. Les résultats montrent la caractérisation de NP, la détection de PAFC, et l'utilisation de NP par microscopie de fluorescence, démontrant de ce fait le potentiel de ce nouveau système pour détecter les CTC ovariens aux concentrations physiologiquement pertinentes.
Introduction
Le cancer de l'ovaire est l'une des tumeurs malignes gynécologiques les plus meurtrières et a entraîné environ 184 800 décès dans le monde en 20181. De multiples études ont montré la corrélation entre la progression du cancer de l'ovaire (c.-à-d. métastes) et la présence des CCT2,3,4. La méthode la plus courante pour la détection et l'isolement des CTC utilise le système Cellsearch, qui cible le récepteur EpCam5. L'expression d'EpCam, cependant, est downregulated dans la transition épithéliale à la transition mésenchymale, qui a....
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Protocole
1. Synthèse et fonctionnalisation des nanoparticules
REMARQUE : La synthèse des NP FA-CuS est réalisée à l'aide d'une méthode de synthèse d'un pot adaptée d'un protocole publié précédemment21.
CAUTION: Toute synthèse doit se produire dans un capot de fumée chimique ventilée.
- Avant la synthèse, filtrer environ 300 ml d'eau déionisée (DI) à l'eau par un filtre stérile de 0,2 m.
- Nettoyer un flacon de fond rond en verre de 250 ml avec une solution de détergent et rincer à l'eau DI. Ajouter 0,0134 g de CuCl2 en 100 ml d'eau DI pour créer une solution de 1 mm.
- Ajouter 0,015 g d'a....
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Résultats
La figure 1A montre une image TEM typique des nanoparticules synthétisées. La taille moyenne de la nanoparticule typique est d'environ 8,6 nm et 2,5 nm. La mesure de nanoparticule a été exécutée dans ImageJ. Des fonctions de seuil et de bassin versant ont été appliquées pour séparer les particules aux fins de mesure. Les diamètres horizontaux et verticaux de chaque particule ont été mesurés perpendiculairement les uns aux autres et ont fait l.......
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Discussion
Ce protocole est une méthode simple pour la détection des CTC ovariens utilisant PAFC et un agent de contraste ciblé de CuS. De nombreuses méthodes ont été explorées pour la détection des CCT ovariens, y compris les dispositifs microfluidiques, RT-PCR, et la cytométrie de flux de fluorescence23,24,25. Ces gammes dans la complexité, le coût, et l'exactitude, limitant leur efficacité dans les arrangements cliniques. PAFC présente .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs aimeraient remercier Madeleine Howell pour son aide dans la synthèse, Matthew Chest pour son aide à la conception du système d'écoulement et Ethan Marschall pour l'aide de SolidWorks.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,025 % de trypsine avec EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 0,2 & micro ; m 1 000 mL Unité de filtration sous vide | VWR | 10040-440 | Pour filtrer de plus grands volumes d’eau DI. |
| 0,2 et micro ; m filtre à seringue stérile | VWR | 28145-477 | |
| Réservoir | Carte d’acquisition | ||
| National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8 canaux, 14 bits | |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Détergent utilisé pour le nettoyage de la verrerie. |
| Filtres centrifuges Amicon Ultra-15 | Millipore | UFC903024 | |
| Filtres centrifuges Amicon Ultra-4 | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hausser | Scientific | 1492 | |
| Chlorure de cuivre(II) | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Objectif de couplage | Thorlabs | LMH-10x-532 | À coupler Lumière pulsée à fibre optique. |
| Platine d’accouplement | Newport | F-91-C1-T | Platine pour l’accouplement de la lumière pulsée à l’objectif. Contient le bain de nettoyage par ultrasons numérique FP-1A et LMH-10x-532 |
| CPX Modèle | Fisherbrand | CPX3800 | |
| logiciel d’acquisition de données | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32 bits) | LabVIEW utilisé pour synchroniser les impulsions laser avec l’acquisition de données. |
| Logiciel de traitement de données | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions et graphiques réalisés à l’aide du logiciel Matlab. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Mandrin de fibre | Newport | FPH-DJ | Utilisé pour maintenir la fibre nue. |
| Coupleur de fibre | Newport | FP-1A | Platine 3 axes pour positionner le mandrin de fibre et la fibre optique au centre de l’objectif. |
| Acide folique | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Grilles TEM revêtues | Microscopie électronique Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy’s 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL SERINGUES | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Fibre optique | Thorlabs | FG550LEC | Utilisé pour exposer l’échantillon à la lumière pulsée. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Pénicilline Streptomycine | GIBCO | 15140-122 | |
| Laser pulsé | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Source laser pulsée avec spécifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Émetteur/récepteur | Olympus | 5077PR | Reçoit, filtre et amplifie les signaux photoacoustiques. Fonctionne avec un gain de 59 dB. |
| Instrument de sutter | tube capillaire en quartz | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Sans acide folique | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cellules | ATCC | HTB-77 | |
| Bicarbonate | de sodium Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Carbonate de sodium | Sigma-Aldrich S7795-500G | ||
| Perles d’hydroxyde de sodium | BDH | BDH9292-500G | |
| Sulfure de sodium non hydraté | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Pompes à seringue | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducteur | Olynmpus | V214-BB-RM | Détecteur à ultrasons avec fréquence centrale de 50 MHz et bande passante fractionnelle de -6 dB de 82 %. |
| Trypan Blue Solution 0.4 % | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Gel à ultrasons | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Gel à ultrasons pour couplage de transducteur |
Références
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al.
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Réimpressions et autorisations
