In vivo optisk calcium billeddannelse af indlærings induceret synaptisk plasticitet i Drosophila melanogaster

Summary

Her præsenterer vi en protokol med hvilken præ-og/eller postsynaptisk calcium kan visualiseres i forbindelse med Drosophila læring og hukommelse. In vivo calcium Imaging ved hjælp af synaptisk lokaliseret calcium sensorer kombineres med en klassisk olfaktoriske conditioning paradigme, således at den synaptiske plasticitet underliggende denne type associative læring kan bestemmes.

Abstract

Årtier af forskning i mange model organismer har ført til den nuværende opfattelse af synaptisk plasticitet underliggende læring og hukommelse dannelse. Lærings-induceret ændringer i synaptisk transmission er ofte fordelt på tværs af mange neuroner og niveauer af behandling i hjernen. Derfor er der behov for metoder til at visualisere indlærings afhængig synaptisk plasticitet på tværs af neuroner. Frugtflue Drosophila melanogaster repræsenterer en særlig gunstig model organisme til at studere neuronal kredsløb underliggende læring. Den protokol, der præsenteres her, viser en måde, hvorpå de processer, der ligger til grund for dannelsen af associative olfaktoriske Memories, nemlig synaptisk aktivitet og deres ændringer, kan overvåges in vivo. Ved hjælp af den brede vifte af genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila, er det muligt specifikt at udtrykke genetisk kodet calcium indikatorer i bestemte cellepopulationer og endda enkeltceller. Ved at fastsætte en flue på plads, og åbne hovedet kapsel, er det muligt at visualisere calcium dynamik i disse celler samtidig levere olfaktoriske stimuli. Derudover demonstrerer vi en opsætning, hvor flue kan udsættes for elektrisk stød på kroppen samtidig. Dette giver et system, hvor fluer kan gennemgå klassisk olfaktoriske conditioning-hvorved en tidligere naiv lugt er lært at være forbundet med elektrisk chok straf-på samme tid som repræsentationen af denne lugt (og andre utrænede lugte) er observeret i hjernen via to-foton mikroskopi. Vores laboratorium har tidligere rapporteret om generering af synaptisk lokaliserede calcium sensorer, som gør det muligt at begrænse de fluorescerende calcium signaler til præ-eller postsynaptiske rum. To-foton mikroskopi giver en måde at spatialt løse fine strukturer. Vi eksemplificere dette ved at fokusere på neuroner integrerer information fra champignon kroppen, en højere orden Center af insektet hjernen. Samlet, denne protokol giver en metode til at undersøge de synaptiske forbindelser mellem neuroner, hvis aktivitet er moduleret som følge af olfaktoriske Learning.

Introduction

Dechifrere hvor og hvordan oplysningerne er erhvervet i hjernen gennem læring og efterfølgende lagret som hukommelse udgør en af de mest udfordrende opgaver i neurovidenskab¹. Neurovidenskabelig forskning har ført til begrebet en ændring i synaptisk transmission som neuronal substrat, der ligger til grund for indlæring og hukommelse dannelse^2,3. Det er en hypotese, at under læring, synaptiske forbindelser mellem neuronal ensembler, der er aktive under opfattelsen af en stimulus bliver modificeret sådan, at deres kombinerede aktivitetsmønster kan hentes under hukommelsen tilbagekaldelse, og dermed instruerede fremtidig adfærdsmæssig handling⁴. Disse “engram celler” og deres synapser er ofte fordelt på tværs af hjernen regioner og niveauer af behandling, hvilket gør det vanskeligt at tildele observerede ændringer i synaptisk transmission til indlæring af en opgave eller en stimulus. At lokalisere og visualisere de synaptiske ændringer, der er kausalt knyttet til en bestemt lærings opgave man har brug for en passende model system, der giver mulighed for præcist at begrænse disse synapser.

For en sådan bestræbelse, Drosophila melanogaster er særligt velegnet, fordi det kombinerer relativ hjernens enkelhed, adfærdsmæssige rigdom, og eksperimentel tilgængelighed. Blandt de veletablerede model organismer, Drosophila er beliggende mellem fyrretræsnematoden C. elegans og genetisk Tractable pattedyr som mus i form af neuronal kompleksitet. Det stereotypiske antal af neuroner (~ 300) og begrænset adfærdsmæssige repertoire er observeret i C. elegans. Pattedyr, på den anden side, har millioner af neuroner og svimlende adfærdsmæssige kompleksitet. Hjernen af frugtflue er, med sin ~ 100.000, neuroner betydeligt mindre end hjernen hos de fleste hvirveldyr, og mange af neuronerne er individuelt identificerbare⁵. Endnu, Drosophila demonstrere et bredt spektrum af komplekse adfærd, herunder en evne til at udvise robust associative olfaktoriske læring og hukommelse dannelse, først beskrevet over 40 år siden⁶. I løbet af denne klassiske konditionerings procedure, er grupper af fluer udsat for en lugt som den konditionerede stimulus (CS⁺), mens de modtager en straffe elektrisk chok som den ukonditionerede STIMULUS (US). En anden lugt (CS^–) er derefter præsenteret uden nogen straf. Derved lærer dyrene at undgå lugt i forbindelse med straffen, som kan testes i en efterfølgende valgsituation mellem de to lugte, CS⁺ og cs^–. Arbejde på dissekere neuronal substrat underliggende denne adfærd i Drosophila har identificeret champignon organer (MB) som det primære sted for “engram”^7,8,9,10 og derfor er kredsløbet af denne hjerneregion var og er genstand for intens forskning for at afdække den logik, hvormed en hukommelse engram er erhvervet og opbevaret (for nylig revideret i^11,12).

Drosophila MB består af ~ 2.000 iboende neuroner (Kenyon celler) pr. halvkugle, organiseret i parallelle axonal projektioner¹³. Axoner af olfaktoriske projektion neuroner udvides til den laterale protocerebra og til MB calyces, den vigtigste dendritiske input site af MB og modtage olfaktoriske input fra antennal lobes. Den lange, parallelle axoner bundt af Kenyon celler udgør pedonkel og lobes. De fleste Kenyon celler bifurcate danner horisontale β/β’-lapper ved at udvide en sikkerhedsstillelse mod midterlinjen af hjernen, og den lodrette α/α’-lapper ved at forlænge anden sikkerhedsstillelse projicering i rygnings-forreste retning. Den anden gruppe af Kenyon celler danner den horisontale γ-lobes¹³ af MB, hvor læringsprocessen og efterfølgende korttidshukommelse dannelse kunne være lokaliseret¹⁰. MB lapper modtage afferent input og give efferent output, som begge er typisk begrænset til særskilte opdelte sub-regioner langs Kenyon Cell axoner^14,15,16. Især, afferent dopaminerge MB input neuroner har vist sig at mægle værdi-baserede, f. eks, straffende, forstærkende effekter i associative olfaktoriske Learning^15,17. Stereotypiske og individuelt identificerbare efferent MB output neuroner fra champignon kroppen lapper integrere oplysninger på tværs af et stort antal Kenyon celler, målrette forskellige hjerneområder og bære adfærd-lærerige appetitive eller aversive oplysninger¹⁵ . Denne neuronal arkitektur har ført til et koncept for organiseringen af associative engram. Lugte er relativt præcist kodet af tyndt aktiverede ensembler af Kenyon celler. Den coinci Dent aktivitet af disse Kenyon Cell ensembler og frigivelse af dopamin-fremkaldt ved at straffe stimuli-modulerer transmission fra Kenyon Cell presynapses på MB output neuroner sådan, at dyrene efterfølgende vil undgå denne særlige lugt^{10 ,12}. Vi bruger denne ret præcist definerede og lokaliseret engram som et paradigmatisk tilfælde til at illustrere, hvordan disse indlærings afhængige ændringer i synaptisk aktivitet kan bestemmes og overvåges.

Værdien af Drosophila som model system er stærkt afhængig af den uovertrufne genetiske værktøjskasse, der gør det muligt at udtrykke transgener til identificering, overvågning og styring af enkelt neuroner i komplekse kredsløb¹⁸. Fremkomsten af teknikker til neuronal aktivitet overvågning-såsom calcium Imaging, diskuteret her-har tilladt til bestemmelse af neuronal aktivitet mønstre som reaktion på en specifik stimulus. Ved at kombinere specifikke Gal4-drevet udtryk af genetisk kodede calcium indikatorer (gecis) med olfaktoriske stimulation, kan man visualisere lugt-fremkaldte calcium dynamik af neuroner af interesse¹⁹. I denne protokol, er det vist, at ved yderligere at koble denne teknik med en klassisk konditionering paradigme, er det muligt at undersøge disse olfaktoriske svar i forbindelse med læring. Lærings induceret plasticitet kan yderligere dissekteres ved hjælp af GECIs, der ikke kun er lokaliseret til en enkelt specifik Neuron, men også til specifikke underafdelinger af en neuron. Pech et al.²⁰ etableret et udvalg af værktøjer, der tillader netop dette. Ved at målrette GCaMP3²¹ til enten præ-eller postsynapse-via-forbindelsen til hvirveldyr Synaptophysin eller dHomer, henholdsvis²⁰-differentialmodulering af disse steder kan skelnes. Denne lokalisering giver i denne sammenhæng en fordel i forhold til de fleste GECIs, der allestedsnærværende er til stede i hele cytosol-fx GCaMP²², GCaMP3²¹, eller GCaMP6²³ -fordi det betyder, at præ-og postsynaptiske transienter kan være adskiller sig fra den samlede integrerede calcium tilstrømning, der opstår som følge af neuron aktivering. Dette kan give fingerpeg om placeringen og typer af plasticitet, der opstår som følge af eller at forårsage indlæring og hukommelse dannelse. Som et eksempel, den protokol, der er angivet her viser værdien af dette værktøj i decifrere graduering af MB output neuroner under olfaktoriske associative Learning ved at målrette ekspression af calcium sensor til kun postsynapse. Ved at overvåge, inden for en individuel flyve, lugt-fremkaldt aktivitet før og efter olfaktoriske conditioning en direkte sammenligning kan trækkes mellem en naiv lugt respons og en lært lugt respons. Mens fast i samme billed kammer, fluer er udsat for et udvalg af lugte. Derefter, de modtager en aversive associative conditioning protokol, hvor en af disse lugte er parret med elektrisk stød (at blive CS⁺) og en anden lugt er præsenteret uden forstærkning (bliver cs^–). Endelig er fluerne igen udsat for de samme lugte som i det første trin. Calcium dynamik observeres ved hjælp af to-foton mikroskopi.

Protocol

1. transgene frugt fluer, Drosophila melanogaster Cross kvindelig jomfru og mandlig fluer (hævet ved 25 ° c i 60% relativ fugtighed på en 12 h lys/mørk cyklus) transporterer den ønskede Gal4 og UAS Konstruer25, henholdsvis at producere fluer, hvor specifikke neuroner af interesse udtrykke en genetisk kodet calcium indikator. Alder den kvindelige afkom af ovenstående Kors, indtil de er i intervallet 3-6 dage post-eclosion. Kvindelige fluer er at foretrække på gr…

Representative Results

Et eksempel på billeder erhvervet med ovenstående protokol kan ses i figur 2. d Homer-GCaMP3 udtrykkes i en MB output Neuron, hvis dendritter inderverer rummet 1 af MB γ-lap (neuron kaldes MVP228,29) og er genetisk målrettet ved hjælp af Split-Gal4 linje MB112C16. Også, demonstreret er forskellen i den subcellulære lokalisering af en cytosolisk og post-synaptisk…

Discussion

Dissektion af neurale kredsløb underliggende læring og hukommelse er et fremtrædende mål inden for neurovidenskab. Den genetiske tilgængelighed af Drosophila og bredden og lethed af adfærdsmæssige test gør dette til et ideelt værktøj til at undersøge sådanne fænomener. Her præsenteres en metode, som det er muligt at visualisere, inden for individuelle fluer, den graduering, der opstår på et subcellulært niveau som følge af olfaktoriske conditioning. Ved at udføre både præ-uddannelse og efter…

Materials

1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican – B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.