Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés

Résumé

Le but de ce protocole est d'isoler les micronavires de plusieurs régions du système nerveux central des vertébrés lissencephalic et gyrencephalic.

Résumé

L'isolement des microvaisseaux du système nerveux central (SNC) est généralement effectué en combinant le tissu cortical de plusieurs animaux, le plus souvent des rongeurs. Cette approche limite l'interrogation des propriétés de la barrière hémato-encéphalique (BBB) au cortex et ne permet pas de comparaison individuelle. Ce projet se concentre sur le développement d'une méthode d'isolement qui permet la comparaison de l'unité neurovasculaire (NVU) à partir de plusieurs régions du SNC : cortex, cervelet, lobe optique, hypothalamus, pituitaire, tronc cérébral et moelle épinière. En outre, ce protocole, initialement développé pour les échantillons de murine, a été adapté avec succès pour une utilisation sur les tissus du SNC à partir de petites et grandes espèces de vertébrés à partir de laquelle nous sommes également en mesure d'isoler les micronavires de la matière blanche de l'hémisphère cérébral. Cette méthode, lorsqu'elle est jumelée à l'immunolabeling, permet la quantitation de l'expression des protéines et la comparaison statistique entre les individus, le type de tissu ou le traitement. Nous avons prouvé cette applicabilité en évaluant des changements dans l'expression de protéine pendant l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), un modèle murine d'une maladie neuroinflammatoire, sclérose en plaques. En outre, les micronavires isolés par cette méthode pourraient être utilisés pour des applications en aval comme qPCR, RNA-seq, et Western blot, entre autres. Même s'il ne s'agit pas de la première tentative d'isoler les micronavires du SNC sans l'utilisation d'ultracentrifugation ou de dissociation enzymatique, il est unique dans son aptitude à la comparaison des individus isolés et de plusieurs régions du SNC. Par conséquent, il permet d'enquêter sur une gamme de différences qui pourraient autrement rester obscures : parties du SNC (cortex, cervelet, lobe optique, tronc cérébral, hypothalamus, pituitaire et moelle épinière), type tissu du SNC (matière grise ou blanche), individus, groupes de traitement expérimental et des espèces.

Introduction

Notre cerveau est l'organe le plus important de notre corps. Pour cette raison, garder l'homéostasie du cerveau en dépit de facteurs externes qui peuvent déclencher une déviation de la normalité est une priorité. Selon certains chercheurs, il y a environ 400 à 500 millions d'années¹, les animaux vertébrés ont développé ce que nous connaissons aujourd'hui comme la barrière hémato-encéphalique (BBB)^2,3. Cette « clôture » protectrice exerce la plus grande influence sur l'homéostasie et les fonctions du système nerveux central (SNC) en régulant étroitement le transport des ions, des molécul....

Protocole

Toutes les procédures de la présente étude sont conformes aux lignes directrices fixées par l'Université de Californie (UC), le Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Les soins aux animaux de l'UC Davis sont réglementés par plusieurs ressources indépendantes et sont entièrement accrédités par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) depuis 1966. Les tissus porcins du SNC ont été obtenus auprès du Département des sciences animales de l'UCD, Laboratoire des sciences de la viande. Les tissus de CNS des macaques de rhesus ont été obtenus du département de pathologie de centre national de primate de....

Résultats

Les microvessels isolés du SNC murine ont montré tous les composants cellulaires intrinsèques de l'unité neurovasculaire^2,3. Utilisation de la molécule d'adhérence des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM, également connue sous le nom de CD31) ou de l'isolectin IB4 (une glycoprotéine qui lie la cellule endothéliale glycocalyx) pour les cellules endothéliales, Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFTRD) ou ant.......

Discussion

Le BBB comprend les propriétés uniques des cellules endothéliales microvasculature du cerveau couplées par une architecture sophistiquée de serré, adherens-, "peg-socket"- jonctions, et plaques d'adhérence critique pour l'homéostasie du SNC^2,3,19. Les propriétés des cellules endothéliales sont induites et maintenues par les péritéytes et les processus d'astroglia environnants^2,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10X PBS	ThermoFisher	BP39920	Utilisé pour le blocage et le diluant d’anticorps.
20 % PFA	Microscopie électronique Sciences	15713-S	Utilisé comme fixateur (4 % PFA)
70 000 MW Dextran	Millipore Sigma	9004-54-0	Utilisé pour la solution MV-2
Adson Forceps	Fine Science Tools (FST)	11006-12	Utilisé pour l’ablation des muscles et de la peau
Adson Forceps, qualité étudiante	FST	91106-12	Identique que ci-dessus mais moins cher
Sérum bovin albumine (BSA)	Millipore Sigma	A7906-100G	Utilisé pour la solution MV-3, le blocage et le diluant d’anticorps
Corning 100 &mu ; m Crépine à cellules	Millipore Sigma	CLS431752-50EA
Corning 70 &mu ; m Filtre à cellules	Millipore Sigma	CLS431751-50EA
Corning Deskwork pointes à faible liaison	Millipore Sigma	CLS4151	Identique que ci-dessous mais moins cher.
Cultrex Poly-D-Lysine	R& D	3439-100-01	Utilisé pour le revêtement en glissement
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555	Thermo	A21432	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-souris IgG-ALEXA 488	Thermo	A21202	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-Lapin IgG-ALEXA 488	Thermo	A21206	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-Lapin IgG-ALEXA 647	Thermo	A31573	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-Rat IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10029	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Pic à tissu à double broche	FST	18067-11	Utilisé pour l’ablation des méninges et du plexus choroïde
Dumont #3c Forceps	FST	11231-20	Utilisé pour la manipulation de tissus du SNC plus délicates et/ou plus petites (comme l’hypophyse)
Dumont #7 Forceps	FST	11274-20	Utilisé pour la dissection et la manipulation du syndrome du SNC
Dumont #7 Forceps, étudiant	FST	91197-00	Identique à ci-dessus mais
moins cher ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips	Eppendorf	22493008	de meilleure qualité que les tips ci-dessus (plus cher).
Pince Graefe extra fine, dentelée	FST	11151-10	Utilisée pour l’ablation des os
Ciseaux fins, tranchants	FST	14060-09	Utilisée pour l’ablation du sac dural du porc et du macaque
Pilon en verre 1,5 mL Microcentrifuge Tube Broyeur de tissus Homogénéisateur, paquet de 10	Chang Bioscience Inc. (eBay)	GP1.5_10	Utilisé pour l’hypothale et l’hypophyse des petits vétébrés.
Anti-CXCL12 de chèvre,	PeproTech	500-P87BGBT	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée : 1:20.
Chèvre anti-JAM-B	R& D	AF1074	Utilisé comme anticorps primaire pour évaluer la neuroinflammation. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Chèvre anti-souris IgG-ALEXA 488	Thermo	A11001	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Anti-souris chèvre IgG-ALEXA 555	Thermo	A21424	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Chèvre anti-PDGFR&beta ;	R& D	AF1042	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Chèvre anti-Lapin IgG-ALEXA 555	Thermo	A21249	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Chèvre anti-Lapin IgG-DyLight 488	Thermo	35552	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Anti-Rat de chèvre IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10021	Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Pince Graefe, pointe incurvée, 1X2 dents	FST	11054-10	Utilisation pour le maintien et l’agitation des filets filtrants en nylon
HBSS, 1X tampon avec calcium et magnésium	Corning	21-022-CM	Utilisé pour la solution MV-1
HEPES, tampon liquide 1M	Corning	25-060-CI	Utilisé pour la solution MV-1
Isolectine GS-IB4-Biotin-XX	ThermoFisher Scientific (Thermo)	I21414	Glycoprotéine isolée de la légumineuse Griffonia simplicifolia qui se lie aux résidus D-galactosyle de la cellule endothéliale glycocalysx. Utilisé pour les microvaisseaux du SNC aviaire et porcin. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Ciseaux LaGrange, dentelés	FST	14173-12	Utilisé pour la dissection du crâne et la laminectomie (sauf porc et macaque)
Lame Millicell EZ unité 8 puits Millipore	Sigma	PEZGS0816
Souris anti-CLDN5	Thermo	35-2500	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Souris anti-GGT1	Abcam	ab55138	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Souris anti-humaine CD31	R& D	BBA7	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC des primates. Concentration recommandée : 16,5 &mu ; g/mL.
Thermo		RMO-270	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Souris anti-&alpha ;SMA	Thermo	MA5-11547	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Filet filtrant en nylon, rouleau	Millipore Sigma	NY6000010	Disques de filet filtrant découpés au laser à 13 mm de diamètre. Utilisé pour les petits hypothales et hypophysaires vétérés.
Filets filtrants en nylon, 25 mm	Millipore Sigma	NY2002500	Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.
Filets filtrants en nylon, 47 mm	Millipore Sigma	NY2004700	Utilisé pour les tissus du SNC des macaques et des porcs, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.
Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPI	ThermoFisher	P36935	Utilisé pour les lames de lamelles.
Lapin anti-AQP4	Millipore Sigma	A5971	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Lapin anti-LSR	Millipore Sigma	SAB2107967	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Lapin anti-NG2	Millipore Sigma	AB5320	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Lapin anti-OSP	Abcam	ab53041	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 1 &mu ; g/mL.
Lapin anti-VE-Cadhérine	Abcam	ab33168	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Lapin anti-ZO-1	Thermo	61-7300	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Rat anti-CD31	Becton Dickinson	BD 550274	Utilisé comme anticorps primaire pour les microvaisseaux murins du SNC. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Anti-GFAP pour rat	Thermo	13-0300	Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Rat anti-VCAM-1	Becton Dickinson	BD 553329	Utilisé comme anticorps primaire pour évaluer la neuroinflammation. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Solution de Ringer stérile, Frog	Aldon Corporation	IS5066	Utilisé pour l’anesthésie amfibienne
Streptavidin-ALEXA 555	Thermo	S32355	Utilisé comme anticorps secondaire pour marquer les anticorps primaires biotinylés. Dilution recommandée de 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647	Thermo	S32357	Utilisé comme anticorps secondaire pour marquer les anticorps primaires biotinylés. Dilution recommandée de 1:500.
Ciseaux chirurgicaux, tranchants	FST	14002-12	Utilisés pour l’ablation des muscles et de la peau
Ciseaux chirurgicaux, tranchants-émoussés	FST	14001-16	Utilisés pour la décapitation (sauf porc et macaque)
Porte-filtre Swinnex, 13 mm	Millipore Sigma	SX0001300	Modifié par découpe laser. Utilisé pour les petits hypothales et hypophysaires vétérés.
Porte-filtre Swinnex, 25 mm	Millipore Sigma	SX0002500	Modifié par découpe laser. Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.
Porte-filtre Swinnex, 47 mm	Millipore Sigma	SX0004700	Modifié par découpe laser. Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.
Triton X-100	ThermoFisher	50-165-7277	Utilisé pour le blocage et le diluant d’anticorps.
Wheaton 120 Vac Overhead Sutterrer	VWR (Fournisseur DWK Life Sciences)	62400-904 (DWK #903475)	Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc avec un broyeur de tissus de 55 ml, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.
Broyeur de tissus Wheaton Potter-Elvehjem avec pilon en PTFE, 10 mL	VWR (Fournisseur DWK Life Sciences)	14231-384 (DWK #357979)	Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.
Broyeur de tissus Wheaton Potter-Elvehjem avec pilon en PTFE, 55 mL	VWR (Fournisseur DWK Life Sciences)	14231-372 (DWK #357994)	Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.

biotinylé