大人のマウスにおける人工内耳表面製剤
Summary
本稿では、大人のマウス人工内耳における免疫組織化学のための人工内皮の10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を付着させるために、細胞および組織接着剤の脱塩および使用を必要とする修飾人工内皮調製方法を提示する。
Abstract
内科における聴覚処理は、メカノ感覚毛髪細胞の完全性に依存する。生涯にわたり、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化プロセスなどの多くの病因から難聴を獲得することができます。感覚性毛細胞の喪失は、後天性難聴の品種の一般的な病理学的特徴である。さらに、内側の毛髪細胞シナプスは軽度の侮辱によって損傷を受けることがある。したがって、人工内耳上皮の表面製剤は、免疫標識技術および共焦点画像と組み合わせて、リボンシナプスおよび感覚毛髪細胞の損失を含む人工内耳病理の調査に非常に有用なツールであり、毛髪細胞および支持細胞におけるタンパク質レベルの変化、毛髪細胞再生、および報告遺伝子発現の決定(すなわち、GFP)は、正常な形質導入および形質転換細胞型の同定を検証する。内耳の骨状螺旋状構造である人工内耳は、聴覚感覚末臓器、コルティ(OC)の器官を保持する。OCの感覚的な毛細胞および周囲の支持細胞は、人工内耳管に含まれ、バジラー膜上に休息し、頂点のベースおよび低周波で発生する高周波検出とトノトピック的な方法で組織化される。分子・遺伝情報の入手可能性とノックアウトやノックイン技術による遺伝子操作能力により、マウスは聴覚科学を含む生物学的研究に広く用いられている。しかし、成体マウスの人工内耳は小さな、人工内皮は骨の迷路に封入され、微小分節が困難になる。解剖技術は多くの実験室で開発され、使用されているが、この修飾されたマイクロ解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、より簡単かつ便利である。これは、脱石後のすべてのタイプの成虫マウスのコクレオに使用することができる。
Introduction
コクレアは音の検出に専念し、聴覚を担当します。人工内耳管は骨部迷路の螺旋状に巻き取られ、聴器感覚末器官であるコルティ(OC)の器官を保持する。OCは、成虫CBA/CaJマウス1、2で巻き取られた場合、約5.7ミリメートルの長さで、人工内皮を構成する、バシラー膜上に置かれる。OCは、ベースで検出された高周波と頂点の低周波数で音位的に組織化されているため、人工内皮は、多くの場合、低に対応するアピカル、ミドル、ベースターンの3つの部分に分かれています。それぞれ、高周波検出。支持細胞の配列に加えて、OCは内側毛細胞(IHC)の1行の内側の毛細胞(IHC)が内側に位置し、人工内耳スパイラルに対して横に位置する3列の外側の毛髪細胞(OHC)で構成されています。
正しい聴覚処理は、内髪の感覚的な毛細胞の完全性に依存する。感覚性毛細胞の損傷または喪失は、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化などの多数の病因によって引き起こされる、後天性難聴の一般的な病理学的特徴であるプロセス3.さらに、内毛細胞/聴神経シナプスの完全性および機能は軽度の侮辱によって損なわれ得る4.分子・遺伝情報の入手とノックアウト技術やノックイン技術による遺伝子の操作により、マウスは聴覚科学に広く用いられている。成体マウス人工内耳はマイナスで、人工内皮は骨カプセルに囲まれており、技術的に困難な微小切片が生じるが、上皮の表面製剤は免疫標識または免疫ヒスト化学と組み合わさってまた、リボンシナプスや毛髪細胞の喪失、感覚性毛細胞や支持細胞のタンパク質レベルの変化、毛細胞の再生など、人工内耳病理の調査に共焦点画像が広く用いられている。人工内耳表面製剤は、レポーター遺伝子(すなわち、GFP)の発現パターンを決定し、正常な伝達を確認し、形質導入された細胞型を同定するためにも使用されている。これらの技術は、これまで成人CBA/Jマウス5、6、7、8、9を用いた騒音誘発難聴の基礎となる分子機構の研究に用いられてきた。
パラフィン切片または凍結切片を用いた免疫ヒストケミストリーとは異なり、各セクションに3つの外側毛細胞(OHC)と1つの内毛細胞(IHC)を含む人工内耳の小さな断面部分を得るために、人工内皮製剤を使用すると、感覚性毛髪細胞およびリボンシナプスをカウントするためのOCの全長の可視化と、特定の機能周波数に対応する感覚性毛髪細胞の免疫標識。表1は、ミュラー1及びヴィベルグ及びキャロン1、2からの研究による成人CBA/Jマウスにおける人工内耳スパイラルの長さに沿った距離の関数としての聴覚周波数のマッピングを示す。人工内耳面製剤は、人工内耳病理4、5、6、7、8、9、10の調査に広く用いられている ,11,12,13,14,15.全体のマウント人工内耳解剖法は、もともと1966年16月にハンス・エングストロームによって編集された本に記載されていました。この技術は、その後、聴覚科学10、11、12、13の多くの科学者によって文献に記載されているように様々な種に精製され、適応された。 15,17とマサチューセッツ目と耳18のイートンピーボディ研究所によって .最近、別の人工内耳解離方法がMontgomeryら19によって報告された。人工内耳の微小解剖は、人工内耳表面製剤にとって不可欠かつ重要なステップである。しかし、マウスのコクレオを解剖することは技術的な課題であり、かなりの練習が必要です。ここで、成体マウス人工内耳に用いるための修飾人工内耳表面調製方法が提示される。この方法は、免疫標識のために人工内皮の断片を10mmラウンドカバースリップに付着させるために、細胞および組織接着剤(すなわち、Cell-Tak)の脱皮および使用を必要とする。細胞および組織接着剤は、免疫組織化学20に広く使用されている。この修飾人工内耳マイクロ分除法は、以前に報告された18、19と比較して比較的簡単である。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫標識と組み合わせた全実装表面製剤の人工内耳分除は、内耳病理および分子機構の調査のための基本的なツールを提供する。この改変された大人のマウス人工内耳解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、この困難な手順を簡素化する。
この修飾人工内耳表面調製方法は比較的容易でアクセスしやすいが、それでも熟練度を達成するためには練習が必要である?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
記載された研究プロジェクトは、国立衛生研究所の国立ろう者・その他のコミュニケーション障害研究所の助成金R01 DC009222によって支援されました。この作業は、MUSCのWRビルで、助成金C06 RR014516によってサポートされる改装された空間で行われました。動物は、国立研究資源センターの村外研究施設プログラムから助成金C06 RR015455によって支援されたMUSC CRI動物施設に収容されました。著者たちは、ヨッヘン・シャハト博士の貴重なコメントとアンドラ・タラカ博士の原稿の校正に感謝する。
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
