वयस्क माउस में कॉकलियर सतह तैयारी
Summary
यह लेख एक संशोधित कॉकलियर सतह तैयारकरने की विधि प्रस्तुत करता है जिसमें वयस्क माउस कॉकलेमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए 10 मिमी गोल कवर स्लिप में कॉकलियर एपिथेलिया के टुकड़ों का पालन करने के लिए एक कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के कैकालसिफिकेशन और उपयोग की आवश्यकता होती है।
Abstract
कॉकलिया में श्रवण प्रसंस्करण मेचनोसेंसरी बालों की कोशिकाओं की अखंडता पर निर्भर करता है। जीवन भर में, अत्यधिक शोर के संपर्क, ओटोटॉक्सिक दवाओं के उपयोग, बैक्टीरियल या वायरल कान संक्रमण, सिर की चोटों और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया जैसे कई एटिओलोजी से सुनवाई हानि प्राप्त की जा सकती है। संवेदी बाल कोशिकाओं का नुकसान अधिग्रहीत सुनवाई हानि की किस्मों की एक आम रोग सुविधा है। इसके अतिरिक्त, आंतरिक बाल कोशिका सिनेप्स हल्के अपमान से क्षतिग्रस्त हो सकता है। इसलिए, इम्यूनोलेबलिंग तकनीकों और कॉन्फोकल इमेजरी के संयोजन में कॉकलियर एपिथेलिया की सतह तैयारी, कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, जिसमें रिबन सिनेप्स और संवेदी बाल कोशिकाओं का नुकसान शामिल है, सफल ट्रांसड्यूक्शन के सत्यापन और ट्रांसड्यूड सेल प्रकारों की पहचान के लिए बाल कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं, बाल कोशिका उत्थान और रिपोर्ट जीन अभिव्यक्ति (यानी, जीएफपी) के निर्धारण में प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन। कोचलिया, आंतरिक कान में एक बोनी सर्पिल के आकार की संरचना, श्रवण संवेदी अंत अंग, कोर्टी (ओसी) के अंग रखती है। ओसी में संवेदी बाल कोशिकाओं और आसपास के सहायक कोशिकाओं को कॉकलियर डक्ट में निहित किया जाता है और बेसिलिसर झिल्ली पर आराम किया जाता है, जो आधार में होने वाली उच्च आवृत्ति का पता लगाने और शीर्ष में कम आवृत्ति के साथ एक टोनोटोपिक फैशन में आयोजित किया जाता है। आणविक और आनुवंशिक जानकारी की उपलब्धता और नॉकआउट और नॉकआउट तकनीकों द्वारा जीन में हेरफेर करने की क्षमता के साथ, चूहों व्यापक रूप से जैविक अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है, सुनवाई विज्ञान में भी शामिल है । हालांकि, वयस्क माउस कॉकलेया छोटा है, और कॉकलियर एपिथेलियम को बोनी भूलभुलैया में समझाया जाता है, जिससे माइक्रोडिसेक्शन मुश्किल हो जाता है। यद्यपि विच्छेदन तकनीकों को कई प्रयोगशालाओं में विकसित और उपयोग किया गया है, सेल और ऊतक चिपकने वाला का उपयोग करने वाली यह संशोधित माइक्रोडिसेक्शन विधि आसान और अधिक सुविधाजनक है। यह decalcification के बाद वयस्क माउस कॉकले के सभी प्रकार में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
कॉकलया ध्वनि का पता लगाने और सुनवाई के लिए जिम्मेदार के लिए समर्पित है। कॉकलियर डक्ट बोनी भूलभुलैया में एक सर्पिल आकार में कुंडलित है और श्रवण संवेदी अंत अंग, कोर्टी (ओसी) के अंग रखती है । ओसी बेसिलियर झिल्ली पर टिकी हुई है, जो कॉकलियर एपिथेलियम बना रही है, जिसकी लंबाई लगभग 5.7 मिमी होती है जब वयस्क सीबीए/सीएजे चूहों1,2में अनकॉइल किया जाता है। क्योंकि ओसी को आधार में पाए गए उच्च आवृत्तियों और शीर्ष में कम आवृत्तियों के साथ आयोजित किया जाता है, कॉकलियर एपिथेलियम को अक्सर विश्लेषणात्मक तुलना के लिए तीन भागों में विभाजित किया जाता है: एपिकल, मध्य और बेसल कम करने के लिए संबंधित हो जाता है, मध्य, और उच्च आवृत्ति का पता लगाने, क्रमशः। सहायक कोशिकाओं की एक सरणी के अलावा, ओसी आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) की एक पंक्ति से बना है जो मध्यस्थ सर्पिल के संबंध में पार्श्व रूप से स्थित बाहरी बाल कोशिकाओं (OHCs) की तीन पंक्तियां स्थित हैं।
सही श्रवण प्रसंस्करण कॉकलिया में संवेदी बाल कोशिकाओं की अखंडता पर निर्भर करता है। संवेदी बाल कोशिकाओं के नुकसान या नुकसान अधिग्रहीत सुनवाई हानि की एक आम रोग सुविधा है, अत्यधिक शोर के संपर्क के रूप में कई etiologies की वजह से, ओटोटॉक्सिक दवाओं का उपयोग, जीवाणु या वायरल कान संक्रमण, सिर चोटों, और उंर बढ़ने प्रोसेस3. इसके अतिरिक्त, आंतरिक बाल कोशिका/श्रवण तंत्रिका सिनेप्स की अखंडता और कार्य हल्के अपमान से बिगड़ा जा सकता है4। आणविक और आनुवंशिक जानकारी की उपलब्धता और नॉकआउट और नॉकआउट तकनीकों द्वारा जीन के हेरफेर के साथ, चूहों व्यापक रूप से विज्ञान सुनवाई में इस्तेमाल किया गया है । यद्यपि वयस्क माउस कॉकललिया मामूली है और कॉकलियर एपिथेलियम एक बोनी कैप्सूल से घिरा हुआ है जिसके परिणामस्वरूप तकनीकी रूप से कठिन माइक्रोडिसेक्शन, इम्यूनोलेबलिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के संयोजन में एपिथेलियम की सतह की तैयारी और कॉन्फोकल इमेजरी का उपयोग मोटे तौर पर कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए किया गया है, जिसमें रिबन सिनेप्स और हेयर सेल्स के नुकसान, संवेदी बालों की कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं और बाल कोशिका उत्थान में प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन शामिल हैं। कॉकलियर सतह की तैयारी का उपयोग रिपोर्टर जीन (यानी जीएफपी) की अभिव्यक्ति के पैटर्न को निर्धारित करने और सफल ट्रांसड्यूक्शन की पुष्टि करने और ट्रांसड्यूड सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए भी किया गया है। इन तकनीकों का उपयोग पहले वयस्क सीबीए/जे चूहों5,6,7,8,9का उपयोग करके शोर-प्रेरित सुनवाई हानि में अंतर्निहित आणविक तंत्रों के अध्ययन के लिए किया गया है ।
कॉकलिया के छोटे क्रॉस-सेक्शनल भागों को प्राप्त करने के लिए पैराफिन सेक्शन या क्रायोसेक्शन का उपयोग करने वाले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के विपरीत जिसमें प्रत्येक खंड पर तीन बाहरी बाल कोशिकाएं (OHCs) और एक आंतरिक हेयर सेल (आईएचसी) होती हैं, कॉकलियर सतह की तैयारी की अनुमति देता है संवेदी बाल कोशिकाओं और रिबन सिनेप्स की गिनती और विशिष्ट कार्यात्मक आवृत्तियों के अनुरूप संवेदी बाल कोशिकाओं की इम्यूनोलेबलिंग के लिए ओसी की पूरी लंबाई का दृश्य। तालिका 1 मुलर1 और विबर्ग और कैनलॉन1,2के अध्ययनों के अनुसार वयस्क सीबीए/जे माउस में कॉकलियर सर्पिल की लंबाई के साथ दूरी के एक समारोह के रूप में सुनवाई आवृत्तियों की मैपिंग को दर्शाता है । कॉकलियर सतह की तैयारी का व्यापक रूप से कॉकलियर विकृतियों4,5,6,7,8,9,10 की जांच के लिए उपयोग किया गया है ,11,12,13,14,15. पूरे माउंट कॉकलियर विच्छेदन विधि मूल रूप से 196616में हंस Engstrom द्वारा संपादित एक पुस्तक में वर्णित किया गया था। बाद में इस तकनीक को परिष्कृत किया गया और विभिन्न प्रजातियों के अनुकूल किया गया जैसा कि विज्ञान10,11,12,13श्रवण में कई वैज्ञानिकों द्वारा साहित्य में वर्णित किया गयाथा , 15,17 और मैसाचुसेट्स आई एंड इयर18में ईटन-पीबॉडी प्रयोगशालाओं द्वारा । हाल ही में, मोंटगोमरी एट अल19द्वारा एक और कॉकलियर विच्छेदन विधि की सूचना दी गई थी । कॉकलियर सतह की तैयारी के लिए कॉकललिया का माइक्रोडिसेक्शन एक आवश्यक और महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, माउस कॉकले को विच्छेदन एक तकनीकी चुनौती है और इसके लिए काफी अभ्यास की आवश्यकता होती है। यहां, वयस्क माउस कॉकले में उपयोग के लिए एक संशोधित कॉकलियर सतह तैयारकरने की विधि प्रस्तुत की जाती है। इस विधि के लिए इम्यूनोलेबलिंग के लिए कॉकलियर एपिथेलियम से 10 मिमी गोल कवरस्लिप तक कॉकलियर एपिथेलियम के टुकड़ों का पालन करने के लिए सेल और ऊतक चिपकने वाले (यानी सेल-टाक) के कैजालिफिकेशन और उपयोग की आवश्यकता होती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री20के लिए सेल और टिश्यू चिपकने वाला व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है । यह संशोधित कॉकलियर माइक्रोडिसेक्शन विधि18,19की रिपोर्ट की गई तुलना में अपेक्षाकृत सरल है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इम्यूनोलेबलिंग के संयोजन में पूरे माउंट सतह की तैयारी का कॉकलियर माइक्रोडिसेक्शन आंतरिक कान विकृतियों और आणविक तंत्र की जांच के लिए एक बुनियादी उपकरण प्रदान करता है। कोशिका और ऊतक चिपकने वाला का उपय…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्णित अनुसंधान परियोजना को राष्ट्रीय बहरापन और अन्य संचार विकारों, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से अनुदान R01 DC009222 द्वारा समर्थित किया गया था । यह काम अनुदान C06 RR014516 द्वारा समर्थित पुनर्निर्मित अंतरिक्ष में MUSC में डब्ल्यूआर बिल्डिंग में आयोजित किया गया था। पशुओं को राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन केंद्र के एक्सट्राम्यूल रिसर्च फैसिलिटीज प्रोग्राम से अनुदान C06 RR015455 द्वारा समर्थित MUSC सीआरआई पशु सुविधाओं में रखे गए थे। लेखक पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग के लिए डॉ जोचेन Schacht और आंद्रा तास्का को उनकी बहुमूल्य टिप्पणियों और आंद्रा तास्का के लिए धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
