Fibroblast-afledt 3D Matrix system gældende for Endotelrørdannelse analyse
Summary
Formålet med denne metode er at opnå fibroblast-afledte 3D matricer som et naturligt stillads for efterfølgende cellulære assays. Fibroblaster siver i en forbehandlet kultur plade og stimuleres med ascorbinsyre til matrix generering. Matricer er decellularized og blokeret for kultur relevante celler (f. eks endotelceller).
Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en tredimensionel stillads, der fungerer som den vigtigste støtte til celler i væv. Ud over sin strukturelle funktion, ECM også deltager i celle migration, spredning, og differentiering. Fibroblaster er den vigtigste type af celler, der modificerer ECM fiber arrangement og produktion. I kræft, CAFs (kræft associerede fibroblaster) er i permanent aktivering status, deltager i ECM Remodeling, lette tumor celle migration, og stimulere tumor-associeret angiogenese, blandt andre Pro-tumorigenic roller. Formålet med denne metode er at skabe en tredimensionel matrix med en fibersammensætning, der svarer til in vivo matricer, ved hjælp af udødeliggjort fibroblaster eller humane primære cafs. Fibroblaster dyrkes i præ-behandlede cellekultur plader og dyrket under ascorbinsyre stimulation. Derefter fjernes fibroblaster, og matricer blokeres for yderligere celle såning. I denne ECM-model, kan fibroblaster aktiveres eller ændres til at generere forskellige slags matrix, hvis virkninger kan undersøgt i cellekultur. 3D matricer er også formet af celle signaler, ligesom nedbrydning eller cross-Linking enzymer, der kan ændre fiber fordeling. I denne sammenhæng kan angiogenese undersøgt, sammen med andre celletyper såsom epiteliale tumorceller.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en dynamisk struktur til stede i alle typer af væv. Det består af proteiner og polysaccharider, der skaber et net af fibre afgørende for celle vedhæftning, migration, og kommunikation1. ECM sammensætning varierer afhængigt af vævet. Mens type-I kollagen er det mest udbredte strukturelle protein, kan kollagen type II, III, V og XI også findes i forskellige væv2. Fibronectin genereret af fibroblaster er nødvendig for celle vedhæftning2. Desuden er der andre strukturelle molekyler som elastin, Laminin og overflade receptorer kaldet integriner at mægle fiber samling og er specifikke for de forskellige ECM væv2. ECM spiller en vigtig rolle som en celle stilladser og kan også være involveret i både fysiologiske og patologiske processer1. Abnormaliteter i ECM er observeret i patologier såsom kræft, som ændrer ECM sammensætning og/eller dets organisation. I tumorer repræsenterer ECM den ikke-cellulære komponent af tumor mikromiljø (TME), en kompleks Milieu af celle komponenter såsom fibroblaster, immunceller, endotelceller, pericytes og en række opløselige faktorer. Det er kendt, at TME fremmer kræft progression og metastase; Cancer-associerede fibroblaster, som en fremherskende celletype i tumor stroma, deltager i denne proces3. I modsætning til normale fibroblaster, CAFs er i permanent aktivering, viser øget sekretion af ECM proteiner og vækstfaktorer (f. eks, omdanne vækstfaktor-β, TGF-β), samt et højere udtryk for nogle markører, såsom α-glat muskel actin (α-SMA) og fibroblast aktivering protein (FAP)4. Men CAFs er en heterogen cellepopulation, der viser forskellige niveauer af aktivering eller markør udtryk5. Det kan antages derefter, at sammensætningen og strukturen af fibroblast-afledte matricer vil afhænge af fibroblast status og egenskaber.
I denne forbindelse er formålet med denne metode at etablere en passende in vitro-model for ECM-produktion ved fibroblaster svarende til in vivo ECM-indstillingen. Vi foreslår denne fremgangsmåde som en in vitro translationel metode til yderligere undersøgelser af tumor celle funktioner, som chemoresistance eller migration, medieret af ECM. Som vores gruppe har offentliggjort andetsteds, CAFs kan fås fra fersk vævsprøver, men det skal bemærkes, at CAFs overlevelse i kulturen er begrænset, og deres celle passage nummer er reduceret6. Desuden kan CAF-primær kulturer, der er etableret ud fra patientprøver, anvendes til matrix generering. Manipulation af genekspression i fibroblaster er også en interessant måde at producere varierede in vitro-matricer til at vurdere de mulige virkninger på matrix sammensætning, fiberorientering osv. På denne linje har vores gruppe for nylig rapporteret om rollen som snegl-udtrykker fibroblaster i sammensætningen og fiber orienteringen af forskellige afledte matricer7.
Desuden er CAFs og ECM involveret i det vaskulære system, både i fartøjets generation og som en del af vasens ydre lag8. ECM remodeling inducerer angiogenese; matrix metalloproteinaser (MMPs) synes at være den vigtigste enzym type, der bidrager til denne proces9,10. Væv vaskularisering af primære celler, der genererer ECMs, ECM makromolekyler, resterende vækstfaktorer inkluderet i ECM, matrix elasticitet, og matrix tykkelse er beskrevet som faktorer involveret i endotel celle aktivering11. I tumorer, hypoksi øger ECM stivhed og endotel spire generation12. Desuden, CAFs udskiller vaskulære endotelial vækstfaktor (VEGF) og trombocytafledt vækstfaktor (PDGF), der stimulerer angiogenese i tumor stroma13. På dette område kan in vitro-matrix generering anvendes til at studere angiogenese-processer eller MMP-handling under forskellige eksperimentelle forhold. Således, in vitro-reproduktion af den mest analoge in vivo matrix kunne være et værdifuldt redskab til at undersøge ECM rolle i angiogenese eller mikro-miljø celle interaktioner.
Stimulering af dyrkede fibroblaster med ascorbinsyre for at forbedre matricen deposition og generere en ECM er en accepteret måde at producere analoge in vivo matricer. Immortalized fibroblast cellelinjer er let kulturperler og aktiveres af forskellige vækstfaktorer, ligesom PDGF-BB, tumor nekrose faktor-α (TNF-α) eller TGF-β14. Inden for TME, cafs syntetisere type-I kollagen og fibronektin som de vigtigste komponenter i ECM4. Tilsvarende findes disse komponenter som større komponenter af in vitro-genererede fibroblast-afledte matricer (figur 1).
Der er forskellige in vitro-metoder til at simulere in vivo ECM. Brugen af coated kultur retter med blandinger af ECM fibre blev forlænget i de seneste år, men denne 2D tilgang nødvendig forbedring til 3D-strukturer, såsom cross-linked gels (f. eks Matrigel)1. Den Matrigel-lignende setup er blevet standardmetode til simulering af en 3D-matrix. Fibrin er også et alternativ, når der genereres matricer, men fejler med hensyn til styrke og holdbarhed af ECM1. Kollagen anvendes i kombination med andre ECM komponenter ændrer nogle af de ovennævnte spørgsmål. Men disse kollagen gels danner et stærkt netværk med fibre, der kan være orienteret, men er meget heterogene, hvilket kan være et problem i eksperiment gentagelser1. Det må dog antages, at anvendelsen af matrigel eller andre silicagelrogeler, afhængigt af formålet med forsøgene, er mere hensigtsmæssig (f. eks. i matrix-sammentrækning undersøgelser, hvor gelsammentrækning let kan påvises).
Den potentielle immunogenicitet af de genererede matricer kan være et problem i eksperimenter med nogle celletyper. Derfor, at reducere muligheden for immunrespons på grund af ECM-genererer celler, når du bruger vores metode, matricer er decellularized og vasket, selv om celle fragment fjernelse ikke kunne være total15. Den ideelle ECM skal være kompatibel med cellekultur og i stand til at kommunikere og reagere på celle signaler. Vores procedure giver mulighed for indførelse af ændringer uden problemer under ECM-produktion (f. eks tilføje fibroblast-stimulerende vækstfaktorer).
Protocol
Representative Results
Discussion
Matricer kan genereres med udødeliggjort fibroblaster eller primære fibroblast kulturer. Fibroblaster er nemme at vedligeholde i in vitro-kultur med en høj vækstrate og stress modstand. De kan endda isoleres fra post mortem-vævet3, selv om kontaminering kan være en begrænsning afhængigt af vævs oprindelsen.
3D-matrixmodel her tilbyder et nyt og effektivt system til succes undersøgelse ECM sammensætning og fiberorientering. Det er også velegnet til analyser a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Udviklingen af denne protokol blev støttet af PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 og RD12/0036/0041 fra Instituto de Salud Carlos III; af Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); af “CIBER de cáncer”, CB16/12/00273 og CB16/12/00446, fra Instituto de Salud Carlos III-FEDER; og af Fundación Científica AECC (en mangesidet tilgang til at målrette kræft i bugspytkirtlen). Cristina Peña er modtager af en Miguel Servet-kontrakt fra Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude hjalp med den engelske tekst. Vi takker Lab medlemmer for hjælp og rådgivning i hele denne forskning.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
