Fibroblast-Dérivé 3D Matrix System Applicable à Endothelial Tube Formation D'Assay
Summary
Le but de cette méthode est d’obtenir des matrices 3D dérivées du fibroblaste comme échafaudage naturel pour les essais cellulaires ultérieurs. Les fibroblastes sont enseventdanss dans une plaque de culture prétraitée et stimulés avec de l’acide ascorbique pour la génération de matrices. Les matrices sont décellularisées et bloquées aux cellules pertinentes à la culture (p. ex., les cellules endothéliales).
Abstract
La matrice extracellulaire (ECM) est un échafaudage tridimensionnel qui agit comme principal support pour les cellules dans les tissus. Outre sa fonction structurelle, l’ECM participe également à la migration cellulaire, à la prolifération et à la différenciation. Les fibroblastes sont le principal type de cellules modifiant l’arrangement et la production de fibres ECM. Dans le cancer, les CAF (fibroblastes associés au cancer) sont dans le statut permanent d’activation, participant au remodelage d’ECM, facilitant la migration de cellules de tumeur, et stimulant l’angiogenèse tumeur-associée, entre autres rôles pro-tumorigenic. L’objectif de cette méthode est de créer une matrice tridimensionnelle avec une composition de fibres qui est similaire aux matrices in vivo, en utilisant des fibroblastes immortalisés ou des CAF primaires humaines. Les fibroblastes sont cultivés dans des plaques de culture cellulaire prétraitées et cultivés sous stimulation acide ascorbique. Ensuite, les fibroblastes sont enlevés et les matrices sont bloquées pour l’ensemencement des cellules. Dans ce modèle ECM, les fibroblastes peuvent être activés ou modifiés pour générer différents types de matrice, dont les effets peuvent être étudiés dans la culture cellulaire. Les matrices 3D sont également façonnées par des signaux cellulaires, comme la dégradation ou les enzymes de liaison croisée qui pourraient modifier la distribution des fibres. Dans ce contexte, l’angiogenèse peut être étudiée, avec d’autres types de cellules telles que les cellules épithéliales.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) est une structure dynamique présente dans tous les types de tissus. Il se compose de protéines et de polysaccharides qui créent un filet de fibres cruciales pour l’adhérence cellulaire, la migration et la communication1. La composition de l’ECM varie selon le tissu. Tandis que le collagène de type I est la protéine structurale la plus répandue, les types de collagène II, III, V et XI peuvent également être trouvés dans divers tissus2. La fibronectine générée par les fibroblastes est nécessaire pour l’adhérence cellulaire2. En outre, il existe d’autres molécules structurelles comme l’élastine, la laminine et les récepteurs de surface appelés integrins qui médiateur assemblage de fibres et sont spécifiques aux différents tissus ECM2. L’ECM joue un rôle important en tant qu’échafaudage cellulaire et peut également être impliqué dans les processus physiologiques et pathologiques1. Des anomalies dans l’ECM sont observées dans des pathologies telles que le cancer, qui modifie la composition de l’ECM et/ou son organisation. Dans les tumeurs, l’ECM représente la composante non cellulaire du microenvironnement tumoral (TME), un milieu complexe de composants cellulaires tels que les fibroblastes, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales, les péricytes et une variété de facteurs solubles. On sait que le TME favorise la progression du cancer et la métastes; les fibroblastes cancéreux-associés, en tant que type de cellule prédominant dans le stroma de tumeur, prennent part à ce processus3. Contrairement aux fibroblastes normaux, les CAC sont en activation permanente, montrant une sécrétion accrue de protéines ECM et de facteurs de croissance (p. ex., Transforming Growth Factor-MD, TGF-MD), ainsi qu’une expression plus élevée de certains marqueurs, tels que l’actine musculaire lisse (-SMA) et la protéine d’activation du fibroblaste (FAP)4. Cependant, les CAT sont une population cellulaire hétérogène, montrant différents niveaux d’activation ou d’expression de marqueur5. On peut alors supposer que la composition et la structure des matrices dérivées du fibroblaste dépendront de l’état et des caractéristiques du fibroblaste.
Dans ce contexte, l’objectif de cette méthodologie est d’établir un modèle in vitro approprié pour la génération d’ECM par des fibroblastes équivalents au réglage In vivo ECM. Nous proposons cette approche comme méthodologie translationnelle in vitro pour d’autres études des fonctions de cellules tumorales, comme la chimiorésistance ou la migration, négociées par ECM. Comme notre groupe l’a publié ailleurs, les FCA peuvent être obtenus à partir d’échantillons de tissus frais, mais il faut noter que la survie des CAF en culture est limitée et leur nombre de passages cellulairesréduit6 . En outre, les cultures primaires des FAC établies à partir d’échantillons de patients peuvent être utilisées pour la génération de matrices. La manipulation de l’expression génique dans les fibroblastes est également une façon intéressante de produire des matrices in vitro variées pour évaluer les effets possibles sur la composition de la matrice, l’orientation des fibres, etc. Dans ce sens, notre groupe a récemment signalé le rôle des fibroblastes exprimant des escargots dans la composition et l’orientation des fibres de diverses matrices dérivées7.
En outre, les CAF et eCM sont impliqués dans le système vasculaire, à la fois dans la génération de navires et dans le cadre de la couche externe de vase8. Le remodelage d’ECM induit l’angiogenèse ; metalloproteinases matrice (MMP) semblent être le type d’enzyme le plus important contribuant à ce processus9,10. La vascularisation tissulaire des cellules primaires qui génèrent les ECM, les macromolécules ECM, les facteurs de croissance résiduels inclus dans l’ECM, l’élasticité de matrice, et l’épaisseur de matrice sont décrits comme facteurs impliqués dans l’activation endothéliale de cellules11. Dans les tumeurs, l’hypoxie augmente la rigidité eCM et la génération de germes endothéliales12. En outre, les CAF sécrètent le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance plaquettaire-dérivé (PDGF) qui stimulent l’angiogenèse dans le stroma de tumeur13. Dans ce domaine, la génération de matrice in vitro pourrait être utilisée pour étudier les processus d’angiogenèse ou l’action MMP dans différentes conditions expérimentales. Ainsi, la reproduction in vitro de la matrice in vivo la plus analogue pourrait être un outil précieux pour étudier le rôle de l’ECM dans l’angiogenèse ou les interactions cellulaires micro-environnementales.
La stimulation des fibroblastes cultivés avec de l’acide ascorbique pour améliorer le dépôt de matrice et générer un ECM est un moyen accepté de produire des matrices in vivo analogues. Les lignées cellulaires de fibroblaste immortalisées sont facilement cultivées et sont activées par divers facteurs de croissance, comme PDGF-BB, Tumor Necrosis Factor-MD (TNF-MD) ouTGF-14. Au sein du TME, les CAF synthétisent le collagène de type I et la fibronectine comme principaux composants de l’ECM4. De même, ces composants sont trouvés comme des composants majeurs des matrices dérivées du fibroblaste générées in vitro (figure 1).
Il existe différentes méthodologies in vitro pour simuler in vivo ECM. L’utilisation de plats de culture enrobés avec des mélanges de fibres ECM a été étendue au cours des dernières années, mais cette approche 2D a nécessité une amélioration des structures 3D, telles que les gels interconnectés (par exemple, Matrigel)1. La configuration matrigel-like est devenu la méthode standard pour simuler une matrice 3D. La fibrine est également une alternative lors de la génération de matrices, mais échoue en termes de force et de durabilité de l’ECM1. Le collagène utilisé en combinaison avec d’autres composants ECM modifie certains des problèmes mentionnés ci-dessus. Cependant, ces gels de collagène forment un réseau fort avec des fibres qui peuvent être orientées, mais sont très hétérogènes, qui peuvent être un problème dans les répétitions d’expérience1. Néanmoins, il faut supposer que, selon l’objectif des expériences, l’utilisation de Matrigel ou d’autres hydrogels est plus appropriée (par exemple, dans les études de contraction matricielle dans lesquelles la contraction du gel peut être facilement détectée).
L’immunogénicité potentielle des matrices générées pourrait être un problème dans les expériences avec certains types de cellules. Par conséquent, pour réduire la possibilité de réponses immunitaires dues aux cellules génératrices d’ECM lors de l’utilisation de notre méthode, les matrices sont décellularisées et lavées, bien que l’ablation des fragments cellulaires ne puisse pas être totale15. L’ECM idéal doit être compatible avec la culture cellulaire et capable de communiquer et de réagir aux signaux cellulaires. Notre procédure permet l’introduction de changements sans difficulté pendant la production d’ECM (par exemple, l’ajout de facteurs de croissance stimulant le fibroblaste).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les matrices peuvent être générées avec des fibroblastes immortalisés ou des cultures primaires de fibroblastes. Les fibroblastes sont faciles à maintenir dans la culture in vitro avec un taux de croissance élevé et une résistance au stress. Ils peuvent même être isolés du tissu post-mortem3, bien que la contamination pourrait être une restriction, selon l’origine du tissu.
Le modèle de matrice 3D offre ici un système nouveau et efficace pour étudier ave…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’élaboration de ce protocole a été soutenue par PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 et RD12/0036/0041 de l’Instituto de Salud Carlos III; par le Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); par “CIBER de Câncer”, CB16/12/00273 et CB16/12/00446, de l’Instituto de Salud Carlos III-FEDER; et par la Fondation Cient-fica AECC (une approche multiforme pour cibler le cancer du pancréas). Cristina Pesa est récipiendaire d’un contrat Miguel Servet de l’Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude a aidé avec le texte anglais. Nous remercions les membres du laboratoire pour leur aide et leurs conseils tout au long de cette recherche.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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