内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム
Summary
この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。
Abstract
細胞外マトリックス(ECM)は、組織の細胞の主な支持体として機能する3次元足場である。その構造的機能に加えて、ECMはまた、細胞の遊走、増殖、および分化に関与する。線維芽細胞は、ECM繊維の配置と生産を修飾する細胞の主なタイプです。癌において、CAF(癌関連線維芽細胞)は永久的な活性化状態にあり、ECMリモデリングに参加し、腫瘍細胞の移行を促進し、腫瘍関連血管新生を刺激し、他のプロ腫瘍形成の役割の間で。この方法の目的は、不死化線維芽細胞またはヒト一次CAFを使用して、生体内行列に類似した繊維組成を有する3次元マトリックスを作成することです。線維芽細胞は、前処理された細胞培養プレートで培養され、アスコルビン酸刺激下で成長する。次いで、線維芽細胞を除去し、マトリックスをさらに細胞播種のためにブロックする。このECMモデルでは、線維芽細胞を活性化または改変して、細胞培養で効果を研究できる異なる種類のマトリックスを生成することができます。3Dマトリックスは、繊維分布を変更する可能性のある分解酵素や架橋酵素などの細胞シグナルによっても形成されます。この文脈において、血管新生は、上皮腫瘍細胞などの他の細胞型と共に研究することができる。
Introduction
細胞外マトリックス(ECM)は、あらゆる種類の組織に存在する動的構造である。これは、細胞接着、移行、および通信1に不可欠な繊維のネットを作成するタンパク質と多糖で構成されています。ECM組成物は、組織によって異なる。I型コラーゲンは最も一般的な構造タンパク質であるが、コラーゲンタイプII、III、V及びXIは種々の組織2にも見られる。線維芽細胞によって生成されるフィブロネクチンは、細胞接着2に必要である。さらに、エラスチン、ラミニンおよび表面受容体のような他の構造分子は、繊維アセンブリを媒介し、異なるECM組織2に特異的であるインテグリンと呼ばれる。ECMは細胞足場として重要な役割を果たし、生理学的および病理学的プロセス1の両方に関与することもできる。ECMの異常は、ECM組成およびその組織を変化させる癌などの病態で観察される。腫瘍において、ECMは、腫瘍微小環境(TME)の非細胞成分、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、ペリサイトおよび様々な可溶性因子などの細胞成分の複合体ミリューを表す。TMEは癌の進行および転移を促進することが知られている;癌関連線維芽細胞は、腫瘍間質における主要な細胞型として、このプロセス3に参加する。正常な線維芽細胞とは異なり、CAFは永久的な活性化において、ECMタンパク質および成長因子の分泌の増加を示す(例えば、増殖因子β、TGF-βの形質転換)、ならびにα平滑筋アクチン(α-SMA)および線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)4のようないくつかのマーカーのより高い発現を示す。しかし、CFは異種細胞集団であり、異なるレベルの活性化またはマーカー発現5を示す。その後、線維芽細胞由来行列の組成および構造は、線維芽細胞の状態および特性に依存すると仮定することができる。
この文脈において、この方法論の目的は、in vivo ECM設定と同等の線維芽細胞によるECM生成のための適切なインビトロモデルを確立することである。このアプローチは、ECMが媒介する化学抵抗や遊走などの腫瘍細胞機能のさらなる研究のためのインビトロ翻訳方法論として提案する。我々のグループが他の場所で発表したように、CFは新鮮な組織サンプルから得ることができるが、培養中のCAFの生存率は限られており、その細胞通過数は6を減少させられることに留意しなければならない。さらに、患者のサンプルから確立されたCAF一次培養物はマトリックス生成に使用することができる。線維芽細胞における遺伝子発現の操作は、マトリックス組成、繊維配向などに対する可能な影響を評価するために、様々なインビトロ行列を生成する興味深い方法でもあります。これらの線に沿って、我々のグループは最近、様々な導出行列7の組成および繊維配向におけるカタツムリ発現線維芽細胞の役割を報告した。
さらに、CFおよびECMは血管系に関与しており、血管生成および花瓶外層8の一部としてである。ECMリモデリングは血管新生を誘発する;マトリックスメタロプロテイナーゼ(MmP)は、このプロセス9、10に寄与する最も重要な酵素タイプであると思われる。ECMを生成する一次細胞の組織血管形成には、ECM高分子、ECMに含まれる残留成長因子、マトリックス弾性、およびマトリックス厚さが内皮細胞活性化に関与する因子として記載されている。腫瘍において、低酸素症はECM剛性および内皮芽世代12を増加させる。また、CAFは、腫瘍間質13における血管新生を刺激する血管内皮増殖因子(VEGF)および血小板由来増殖因子(PDGF)を分泌する。この分野では、in vitroマトリックス生成を使用して、異なる実験条件下で血管新生プロセスまたはMMP作用を研究することができる。したがって、生体内マトリックスの最も類似したインビトロ再生は、血管新生またはマイクロ環境細胞相互作用におけるECMの役割を調査するための貴重なツールであり得る。
アスコルビン酸を用いた培養線維芽細胞の刺激は、マトリックス沈着を増強し、ECMを生成し、生体内行列で類似の生成方法として受け入れられている。不死化線維芽細胞株は容易に培養され、PDGF-BB、腫瘍壊死因子α(TNF-α)またはTGF-β14のような多様な増殖因子によって活性化される。TME内では、CAFはECM4の主要成分としてタイプIコラーゲンとフィブロネクチンを合成する。同様に、これらの成分は、インビトロ生成線維芽細胞由来行列の主要成分として見られる(図1)。
生体内ECMをシミュレートするインビトロ方法論は異なります。ECM繊維の混合物を用いたコーティング培養皿の使用は過去数年間に拡張されたが、この2Dアプローチは架橋ゲル(例えば、マトリゲル)1のような3D構造の改善を必要とする。Matrigel のようなセットアップは、3D マトリックスをシミュレートするための標準的な方法となっています。フィブリンはまた、行列を生成する際の代替手段であるが、ECM1の強度と耐久性の点で失敗します.他のECM成分と組み合わせて使用されるコラーゲンは、上記の問題のいくつかを修正します。しかしながら、これらのコラーゲンゲルは、配向できる繊維を有する強いネットワークを形成するが、非常に異種であり、実験の繰り返し1において問題となり得る。それにもかかわらず、実験の目的に応じて、マトリゲルまたは他のヒドロゲルの使用がより適切であると仮定しなければならない(例えば、ゲル収縮を容易に検出できるマトリックス収縮研究において)。
生成されたマトリックスの潜在的な免疫原性は、いくつかの細胞タイプの実験における問題である可能性があります。従って、我々の方法を用いた場合にECM発生細胞による免疫応答の可能性を低減するために、マトリックスは脱細胞化され洗浄されるが、細胞断片除去は合計15でなかった。理想的なECMは、細胞培養と互換性があり、細胞信号と通信して反応できる必要があります。私たちの手順は、ECM生産中に難なく変化の導入を可能にします(例えば、線維芽細胞刺激成長因子を追加)。
Protocol
Representative Results
Discussion
マトリックスは、不死化線維芽細胞または原発性線維芽細胞培養物で生成することができる。線維芽細胞は、高い成長速度とストレス耐性を有するインビトロ培養で維持することが容易です。それらは死後の組織3から単離することもできるが、汚染は組織の起源に応じて制限される可能性がある。
ここでの3Dマトリックスモデルは、ECM組成と繊維配向?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの開発は、PI12/02037、PI15/02101、PI17/01847、PI18/01034 および RD12/0036/0041 Instituto de Salud Carlos III からサポートされました。フォンド・ヨーロッパ・デ・デサロロ地域(FEDER) によって;「CIBER de Cancer」によって, CB16/12/00273 と CB16/12/00446, サルド・カルロス3世-フェーダーのインスティトゥートから;そして、フンダシオン・シエンティフィカAECC(膵臓癌を標的とする多面的なアプローチ)によって。クリスティーナ・ペーニャは、サルド・カルロス3世のミゲル・サーブト契約を受領しています。M.オードは英語のテキストを手伝いました。この研究を通じて、ラボメンバーの皆様の助けとアドバイスに感謝します。
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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