Цель этого метода заключается в получении фибробластов полученных 3D матрицы в качестве естественного эшафота для последующих клеточных анализов. Фибробласты засеяны в предварительно обработанной культуре пластины и стимулируются аскорбиновой кислотой для генерации матрицы. Матрицы децеллюляризируются и блокируются для культуры соответствующих клеток (например, эндотелиальных клеток).
Внеклеточная матрица (ECM) представляет собой трехмерную эшафот, которая выступает в качестве основной опоры для клеток в тканях. Помимо своей структурной функции, ECM также участвует в миграции клеток, распространении и дифференциации. Фибробласты являются основным типом клеток, изменяющих расположение и производство волокон ECM. При раке, CAFs (рак связанных фибробластов) находятся в постоянном статусе активации, участвуя в ECM ремоделирования, содействие миграции опухолевых клеток, а также стимулирование опухолевых ангиогенез, среди других про-опухолевих ролей. Целью этого метода является создание трехмерной матрицы с составом волокон, который похож на in vivo матрицы, используя увековеченные фибробласты или человеческие первичные CAFs. Фибробласты культивируются в предварительно обработанных плитах клеточной культуры и выращиваются под стимуляцией аскорбиновой кислоты. Затем фибробласты удаляются и матрицы блокируются для дальнейшего посева клеток. В этой модели ECM фибробласты могут быть активированы или изменены для создания различных видов матрицы, эффекты которых могут быть изучены в клеточной культуре. 3D матрицы также формируются клеточными сигналами, такими как деградация или перекрестные ферменты, которые могут изменить распределение волокон. В этом контексте, ангиогенез может быть изучен, наряду с другими типами клеток, таких как эпителиальные опухолевые клетки.
Внеклеточная матрица (ECM) представляет собой динамическую структуру, присутствующее во всех типах тканей. Он состоит из белков и полисахаридов, которые создают сеть волокон, имеющих решающее значение для клеточной слипа, миграции и связи1. Состав ECM варьируется в зависимости от ткани. В то время как коллаген i типа является наиболее распространенным структурным белком, коллагеновытипы II, III, V и XI также можно найти в различных тканях2. Фибронектин, генерируемый фибробластами, необходим для клеточной адгезии2. Кроме того, Есть другие структурные молекулы, как эластин, ламинин и поверхностные рецепторы, называемые интегрины, которые посредничата сборки волокна и специфичны для различных тканей ECM2. ECM играет важную роль в качестве клеточного эшафота, а также может быть вовлечен как в физиологические, так и в патологические процессы1. Аномалии в ECM наблюдаются при патологиях, таких как рак, который изменяет состав ECM и/или его организацию. В опухолях ECM представляет собой неклеточный компонент микроокружения опухоли (TME), сложную среду клеточных компонентов, таких как фибробласты, иммунные клетки, эндотелиальные клетки, перициты и различные растворимые факторы. Известно, что TME способствует прогрессированию рака и метастазам; связанных с раком фибробластов, как преобладающий тип клеток в опухолевой строми, принимают участие в этом процессе3. В отличие от нормальных фибробластов, ЦАО находятся в постоянной активации, показывая повышенную секрецию белков ECM и факторов роста (например, Преобразование фактор роста-я, TGF-я), а также более высокое выражение некоторых маркеров, таких как плавный актин мышц (З-СМА) и активация белка фибробласта (FAP)4. Тем не менее, CAFs являются неоднородной популяции клеток, показывая различные уровни активации или маркер ажиотажавыражение 5. Можно предположить, что состав и структура фибробластов, полученных от матриц, будет зависеть от статуса и характеристик фибробласта.
В этом контексте цель этой методологии заключается в создании соответствующей модели in vitro для генерации ECM фибробластами, эквивалентной настройкам in vivo ECM. Мы предлагаем такой подход в качестве метода перевода in vitro для дальнейших исследований функций опухолевых клеток, таких как химиорезация или миграция, опосредованных ECM. Как наша группа опубликовала в другом месте, CAFs могут быть получены из свежих образцов тканей, но это должно быть отмечено, что выживание CAFs в культуре ограничено, и их число прохода клеток уменьшается6. Кроме того, первичные культуры CAF, созданные из образцов пациентов, могут использоваться для генерации матрицы. Манипуляция экспрессией генов в фибробластах также является интересным способом получения разнообразных матриц в пробирке для оценки возможного воздействия на матричную композицию, ориентацию на волокна и т.д. В этом направлении, наша группа недавно сообщила о роли улитки-выражения фибробластов в составе и волоконной ориентации различных производных матриц7.
Кроме того, ЦАФы и ECM участвуют в сосудистой системе, как в генерации сосудов, так и в составе наружного слоя вазы8. ECM ремоделирования вызывает ангиогенез; матричные металлопротеины (ММП), как представляется, наиболее важным типом фермента, способствующего этому процессу9,10. Васкуляризация тканей первичных клеток, генерируют ЭКМ, макромолекулы ECM, остаточные факторы роста, включенные в ECM, матричную эластичность и толщину матрицы, описаны как факторы, участвующие в эндотелиальной активации клеток11. При опухолях гипоксия повышает жесткость ЭКМ и эндотелиальный росток поколения12. Кроме того, CAFs выделяют сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и тромбоцитов полученных фактор роста (PDGF), которые стимулируют ангиогенез в опухолевой строми13. В этой области, в пробирке матричной генерации может быть использован для изучения ангиогенеза процессов или MMP действий в различных экспериментальных условиях. Таким образом, воспроизведение в пробирке наиболее аналогичной матрицы in vivo может быть ценным инструментом для изучения роли ECM в ангиогенезе или микро-экологических клеточных взаимодействий.
Стимуляция культивированных фибробластов аскорбиновой кислотой для улучшения матричного осаждения и создания ECM является общепринятым способом производства аналогичных матриц виво. Увековеченные линии фибробластных клеток легко культивируются и активируются различными факторами роста, такими как PDGF-BB, Фактор некроза опухолей (ТНФ-я) илиTGF-14. В рамках TME, CAFs синтезировать тип I коллагена и фибронектина в качестве основных компонентов ECM4. Аналогичным образом, эти компоненты находятся в качестве основных компонентов в пробирке генерируемых фибробластов полученных матриц(Рисунок 1).
Существуют различные методологии in vitro для имитации in vivo ECM. Использование покрытой культуры блюда со смесями ECM волокон был продлен в прошлые годы, но этот 2D подход нуждается в улучшении 3D структур, таких как кросс-связанные гели (например, Matrigel)1. Установка типа Matrigel стала стандартным методом моделирования 3D-матрицы. Фибрин также является альтернативой при генерации матриц, но не с точки зрения прочности и долговечности ECM1. Коллаген, используемый в сочетании с другими компонентами ECM, вносит изменения в некоторые из вышеупомянутых проблем. Тем не менее, эти гели коллагена образуют сильную сеть с волокнами, которые могут быть ориентированы, но очень неоднородны, что может быть проблемой в экспериментах повторений1. Тем не менее, следует предположить, что, в зависимости от цели экспериментов, использование Matrigel или других гидрогелей является более целесообразным (например, в исследованиях сокращения матриц, в которых сокращение геля может быть легко обнаружено).
Потенциальная иммуногенность генерируемых матриц может быть проблемой в экспериментах с некоторыми типами клеток. Таким образом, чтобы уменьшить вероятность иммунных реакций из-за ECM генерирующих клеток при использовании нашего метода, матрицы децеллюляризованы и промываются, хотя удаление фрагментов клеток не может быть всего15. Идеальный ECM должен быть совместим с клеточной культурой и уметь общаться и реагировать на сигналы клеток. Наша процедура позволяет вводить изменения без затруднений при производстве ECM (например, добавление фибробласт-стимулирующих факторов роста).
Матрицы могут быть созданы с увековеченными фибробластами или первичными культурами фибробластов. Фибробласты легко поддерживать в культуре in vitro с высокими темпами роста и стрессоустойчивостью. Они могут быть даже изолированы от посмертной ткани3, хотя загрязнение може?…
The authors have nothing to disclose.
Разработка этого протокола была поддержана PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 и RD12/0036/0041 от Института Салуда Карлоса III; по Фондо Европао де Десарролло Региональный (FEDER); “CIBER де Кансер”, CB16/12/00273 и CB16/12/00446, от Института Салуд Карлос III-ФЕДЕР; и Фондом Кьентифика АЕКК (многогранный подход к борьбе с раком поджелудочной железы). Кристина Пенья является получателем контракта Мигеля Серве тазна от Института Салуд Карлос III. М. Иод помогал с английским текстом. Мы благодарим сотрудников лаборатории за помощь и советы на протяжении всего этого исследования.
Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
Triton X100 | Roth | 3051 | |
Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |