Фибробласт-Производные 3D Матричная система применима к эндотелиальной трубе Формирование Ассай
Summary
Цель этого метода заключается в получении фибробластов полученных 3D матрицы в качестве естественного эшафота для последующих клеточных анализов. Фибробласты засеяны в предварительно обработанной культуре пластины и стимулируются аскорбиновой кислотой для генерации матрицы. Матрицы децеллюляризируются и блокируются для культуры соответствующих клеток (например, эндотелиальных клеток).
Abstract
Внеклеточная матрица (ECM) представляет собой трехмерную эшафот, которая выступает в качестве основной опоры для клеток в тканях. Помимо своей структурной функции, ECM также участвует в миграции клеток, распространении и дифференциации. Фибробласты являются основным типом клеток, изменяющих расположение и производство волокон ECM. При раке, CAFs (рак связанных фибробластов) находятся в постоянном статусе активации, участвуя в ECM ремоделирования, содействие миграции опухолевых клеток, а также стимулирование опухолевых ангиогенез, среди других про-опухолевих ролей. Целью этого метода является создание трехмерной матрицы с составом волокон, который похож на in vivo матрицы, используя увековеченные фибробласты или человеческие первичные CAFs. Фибробласты культивируются в предварительно обработанных плитах клеточной культуры и выращиваются под стимуляцией аскорбиновой кислоты. Затем фибробласты удаляются и матрицы блокируются для дальнейшего посева клеток. В этой модели ECM фибробласты могут быть активированы или изменены для создания различных видов матрицы, эффекты которых могут быть изучены в клеточной культуре. 3D матрицы также формируются клеточными сигналами, такими как деградация или перекрестные ферменты, которые могут изменить распределение волокон. В этом контексте, ангиогенез может быть изучен, наряду с другими типами клеток, таких как эпителиальные опухолевые клетки.
Introduction
Внеклеточная матрица (ECM) представляет собой динамическую структуру, присутствующее во всех типах тканей. Он состоит из белков и полисахаридов, которые создают сеть волокон, имеющих решающее значение для клеточной слипа, миграции и связи1. Состав ECM варьируется в зависимости от ткани. В то время как коллаген i типа является наиболее распространенным структурным белком, коллагеновытипы II, III, V и XI также можно найти в различных тканях2. Фибронектин, генерируемый фибробластами, необходим для клеточной адгезии2. Кроме того, Есть другие структурные молекулы, как эластин, ламинин и поверхностные рецепторы, называемые интегрины, которые посредничата сборки волокна и специфичны для различных тканей ECM2. ECM играет важную роль в качестве клеточного эшафота, а также может быть вовлечен как в физиологические, так и в патологические процессы1. Аномалии в ECM наблюдаются при патологиях, таких как рак, который изменяет состав ECM и/или его организацию. В опухолях ECM представляет собой неклеточный компонент микроокружения опухоли (TME), сложную среду клеточных компонентов, таких как фибробласты, иммунные клетки, эндотелиальные клетки, перициты и различные растворимые факторы. Известно, что TME способствует прогрессированию рака и метастазам; связанных с раком фибробластов, как преобладающий тип клеток в опухолевой строми, принимают участие в этом процессе3. В отличие от нормальных фибробластов, ЦАО находятся в постоянной активации, показывая повышенную секрецию белков ECM и факторов роста (например, Преобразование фактор роста-я, TGF-я), а также более высокое выражение некоторых маркеров, таких как плавный актин мышц (З-СМА) и активация белка фибробласта (FAP)4. Тем не менее, CAFs являются неоднородной популяции клеток, показывая различные уровни активации или маркер ажиотажавыражение 5. Можно предположить, что состав и структура фибробластов, полученных от матриц, будет зависеть от статуса и характеристик фибробласта.
В этом контексте цель этой методологии заключается в создании соответствующей модели in vitro для генерации ECM фибробластами, эквивалентной настройкам in vivo ECM. Мы предлагаем такой подход в качестве метода перевода in vitro для дальнейших исследований функций опухолевых клеток, таких как химиорезация или миграция, опосредованных ECM. Как наша группа опубликовала в другом месте, CAFs могут быть получены из свежих образцов тканей, но это должно быть отмечено, что выживание CAFs в культуре ограничено, и их число прохода клеток уменьшается6. Кроме того, первичные культуры CAF, созданные из образцов пациентов, могут использоваться для генерации матрицы. Манипуляция экспрессией генов в фибробластах также является интересным способом получения разнообразных матриц в пробирке для оценки возможного воздействия на матричную композицию, ориентацию на волокна и т.д. В этом направлении, наша группа недавно сообщила о роли улитки-выражения фибробластов в составе и волоконной ориентации различных производных матриц7.
Кроме того, ЦАФы и ECM участвуют в сосудистой системе, как в генерации сосудов, так и в составе наружного слоя вазы8. ECM ремоделирования вызывает ангиогенез; матричные металлопротеины (ММП), как представляется, наиболее важным типом фермента, способствующего этому процессу9,10. Васкуляризация тканей первичных клеток, генерируют ЭКМ, макромолекулы ECM, остаточные факторы роста, включенные в ECM, матричную эластичность и толщину матрицы, описаны как факторы, участвующие в эндотелиальной активации клеток11. При опухолях гипоксия повышает жесткость ЭКМ и эндотелиальный росток поколения12. Кроме того, CAFs выделяют сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и тромбоцитов полученных фактор роста (PDGF), которые стимулируют ангиогенез в опухолевой строми13. В этой области, в пробирке матричной генерации может быть использован для изучения ангиогенеза процессов или MMP действий в различных экспериментальных условиях. Таким образом, воспроизведение в пробирке наиболее аналогичной матрицы in vivo может быть ценным инструментом для изучения роли ECM в ангиогенезе или микро-экологических клеточных взаимодействий.
Стимуляция культивированных фибробластов аскорбиновой кислотой для улучшения матричного осаждения и создания ECM является общепринятым способом производства аналогичных матриц виво. Увековеченные линии фибробластных клеток легко культивируются и активируются различными факторами роста, такими как PDGF-BB, Фактор некроза опухолей (ТНФ-я) илиTGF-14. В рамках TME, CAFs синтезировать тип I коллагена и фибронектина в качестве основных компонентов ECM4. Аналогичным образом, эти компоненты находятся в качестве основных компонентов в пробирке генерируемых фибробластов полученных матриц(Рисунок 1).
Существуют различные методологии in vitro для имитации in vivo ECM. Использование покрытой культуры блюда со смесями ECM волокон был продлен в прошлые годы, но этот 2D подход нуждается в улучшении 3D структур, таких как кросс-связанные гели (например, Matrigel)1. Установка типа Matrigel стала стандартным методом моделирования 3D-матрицы. Фибрин также является альтернативой при генерации матриц, но не с точки зрения прочности и долговечности ECM1. Коллаген, используемый в сочетании с другими компонентами ECM, вносит изменения в некоторые из вышеупомянутых проблем. Тем не менее, эти гели коллагена образуют сильную сеть с волокнами, которые могут быть ориентированы, но очень неоднородны, что может быть проблемой в экспериментах повторений1. Тем не менее, следует предположить, что, в зависимости от цели экспериментов, использование Matrigel или других гидрогелей является более целесообразным (например, в исследованиях сокращения матриц, в которых сокращение геля может быть легко обнаружено).
Потенциальная иммуногенность генерируемых матриц может быть проблемой в экспериментах с некоторыми типами клеток. Таким образом, чтобы уменьшить вероятность иммунных реакций из-за ECM генерирующих клеток при использовании нашего метода, матрицы децеллюляризованы и промываются, хотя удаление фрагментов клеток не может быть всего15. Идеальный ECM должен быть совместим с клеточной культурой и уметь общаться и реагировать на сигналы клеток. Наша процедура позволяет вводить изменения без затруднений при производстве ECM (например, добавление фибробласт-стимулирующих факторов роста).
Protocol
Representative Results
Discussion
Матрицы могут быть созданы с увековеченными фибробластами или первичными культурами фибробластов. Фибробласты легко поддерживать в культуре in vitro с высокими темпами роста и стрессоустойчивостью. Они могут быть даже изолированы от посмертной ткани3, хотя загрязнение може?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Разработка этого протокола была поддержана PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 и RD12/0036/0041 от Института Салуда Карлоса III; по Фондо Европао де Десарролло Региональный (FEDER); “CIBER де Кансер”, CB16/12/00273 и CB16/12/00446, от Института Салуд Карлос III-ФЕДЕР; и Фондом Кьентифика АЕКК (многогранный подход к борьбе с раком поджелудочной железы). Кристина Пенья является получателем контракта Мигеля Серве тазна от Института Салуд Карлос III. М. Иод помогал с английским текстом. Мы благодарим сотрудников лаборатории за помощь и советы на протяжении всего этого исследования.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
