Syftet med denna metod är att få fibroblast-härledda 3D-matriser som en naturlig byggnadsställning för efterföljande cellulära analyser. Fibroblaster är seedade i en pre-behandlade odlingsplattan och stimuleras med askorbinsyra för Matrix generation. Matriserna är decellularized och blockeras för att odla relevanta celler (t. ex. endotelceller).
Den extracellulära matrix (ECM) är en tredimensionell byggnadsställning som fungerar som det viktigaste stödet för celler i vävnader. Förutom sin strukturella funktion deltar ECM också i cell migration, spridning och differentiering. Fibroblaster är den huvudsakliga typen av celler modifiera ECM fiber arrangemang och produktion. I cancer, CAFs (cancer associerade fibroblaster) är i permanent aktiveringsstatus, deltar i ECM remodeling, underlätta tumör cell migration, och stimulera tumör-associerad angiogenes, bland andra Pro-tumorigenic roller. Syftet med denna metod är att skapa en tredimensionell matris med en fiber komposition som liknar in vivo matriser, med hjälp av förevigade fibroblaster eller mänskliga primära CAFs. Fibroblaster är odlade i förbehandlade cellkulturer plattor och odlas under askorbinsyra stimulering. Sedan, fibroblaster avlägsnas och matriser blockeras för ytterligare cell seedning. I denna ECM-modell kan fibroblaster aktiveras eller modifieras för att generera olika typer av matris, vars effekter kan studeras i cellkulturen. 3D-matriser formas också av cell signaler, som nedbrytning eller tvär bindnings ande enzymer som kan förändra fiber distributionen. I detta sammanhang, angiogenes kan studeras, tillsammans med andra celltyper såsom epitelial tumörceller.
Den extracellulära matrix (ECM) är en dynamisk struktur som finns i alla typer av vävnad. Den består av proteiner och polysackarider som skapar ett nät av fibrer avgörande för celladhesion, migration, och kommunikation1. ECM-sammansättningen varierar beroende på vävnaden. Medan typ-I kollagen är det vanligaste strukturella proteinet, kollagentyper II, III, V och XI kan också hittas i olika vävnader2. Fibronectin som genereras av fibroblaster behövs för celladhesion2. Dessutom finns det andra strukturella molekyler som elastin, laminin och ytan receptorer kallas integriner att medla fiber montering och är specifika för de olika ECM vävnader2. ECM spelar en viktig roll som en cell byggnadsställning och kan också vara involverade i både fysiologiska och patologiska processer1. Avvikelser i ECM observeras i patologier som cancer, som förändrar ECM sammansättning och/eller dess organisation. I tumörer, ECM representerar icke-cellulära komponenten i tumören mikromiljö (TME), en komplex miljö av cellkomponenter såsom fibroblaster, immunceller, endotelceller, pericyter och en mängd lösliga faktorer. Det är känt att TME främjar cancer progression och metastaser; cancer-associerade fibroblaster, som en dominerande celltyp i tumören stroma, delta i denna process3. Till skillnad från vanliga fibroblaster, Cafs är i permanent aktivering, visar ökad utsöndring av ECM proteiner och tillväxtfaktorer (t. ex., omvandla tillväxtfaktor-β, TGF-β), samt ett högre uttryck av vissa markörer, såsom α-glatt mus kula ring aktin (α-SMA) och fibroblast aktiverings protein (FAP)4. Emellertid, CAFs är en heterogen cellpopulation, visar olika nivåer av aktivering eller markör uttryck5. Det kan antas då att sammansättningen och strukturen av fibroblast-härledda matriser kommer att bero på fibroblast status och egenskaper.
I detta sammanhang är målet med denna metod att etablera en lämplig in vitro-modell för ECM-generering av fibroblaster som motsvarar in vivo ECM-inställningen. Vi föreslår detta tillvägagångssätt som en in vitro-translationell metodik för fortsatta studier av tumör cells funktioner, som kemoresistens eller migration, medierad av ECM. Som vår grupp har publicerat någon annanstans, CAFs kan erhållas från färska vävnadsprover, men det måste noteras att CAFs överlevnad i kulturen är begränsad och deras cell passage nummer reduceras6. Dessutom kan CAF-grundkulturer som etablerats från patienters prover användas för matrisgenerering. Manipulation av genuttryck i fibroblaster är också ett intressant sätt att producera varierade in vitro-matriser för att bedöma de möjliga effekterna på Matrix sammansättning, fiber orientering, etc. Längs dessa linjer, vår grupp har nyligen rapporterat rollen av snigel-uttrycker fibroblaster i sammansättningen och fiber orientering av olika härledda matriser7.
Dessutom är CAFs och ECM involverade i kärlsystemet, både i fartygs generationen och som en del av vasen yttre lagret8. ECM remodeling inducerar angiogenes; Matrix metalloproteinaser (MMPs) verkar vara den viktigaste enzym typ som bidrar till denna process9,10. Vävnaden vaskularisering av primära celler som genererar ECMS, ECM makromolekyler, kvarvarande tillväxtfaktorer som ingår i ECM, Matrix elasticitet, och Matrix tjocklek beskrivs som faktorer inblandade i endotelceller cell aktiveringen11. I tumörer, hypoxi ökar ECM styvhet och endotelial spira generation12. Dessutom, CAFs utsöndrar vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och trombocytderivat tillväxtfaktor (PDGF) som stimulerar angiogenes i tumör stroma13. Inom detta område, in vitro Matrix generation kan användas för att studera angiogenes processer eller MMP åtgärder under olika experimentella förhållanden. Således kan in vitro-reproduktion av den mest analoga in vivo Matrix vara ett värdefullt verktyg för att undersöka ECM: s roll i angiogenes eller mikro-miljö cell interaktioner.
Stimulering av odlade fibroblaster med askorbinsyra för att förbättra Matrix deposition och generera en ECM är ett accepterat sätt att producera analoga in vivo matriser. Förevigat fibroblast cellinjer är lätt odlade och aktiveras av olika tillväxtfaktorer, som PDGF-BB, tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) eller TGF-β14. Inom TME, Cafs syntetisera typ-I kollagen och Fibronektin som de viktigaste komponenterna i ECM4. Likaså, dessa komponenter finns som viktiga komponenter i in vitro-genererade fibroblast-härledda matriser (figur 1).
Det finns olika in vitro-metoder för att simulera in vivo ECM. Användningen av belagda kultur rätter med blandningar av ECM-fibrer förlängdes under de senaste åren, men denna 2D-strategi behövde förbättras för 3D-strukturer, såsom tvärbunden gel (t. ex. Matrigel)1. Den Matrigel-liknande installationen har blivit standardmetod för simulering av en 3D-matris. Fibrin är också ett alternativ när man genererar matriser men misslyckas i termer av styrka och hållbarhet av ECM1. Kollagen som används i kombination med andra ECM komponenter ändrar några av de ovan nämnda frågorna. Men dessa kollagen geler bildar ett starkt nätverk med fibrer som kan orienteras, men är mycket heterogena, vilket kan vara ett problem i experiment repetitioner1. Det måste dock antas att, beroende på syftet med experimenten, användningen av matrigel eller andra hydrogeler är lämpligare (t. ex. i matriskontraktion studier där gelkontraktion lätt kan upptäckas).
Den potentiella immunogeniciteten hos de genererade matriserna kan vara ett problem i experiment med vissa celltyper. Därför, för att minska risken för immunsvar på grund av ECM-producerande celler när du använder vår metod, matriser är decellularized och tvättas, även om cell fragment avlägsnande inte kunde vara totalt15. Den ideala ECM måste vara kompatibel med cellkultur och kunna kommunicera och reagera på cell signaler. Vårt förfarande gör det möjligt att införa förändringar utan svårighet under ECM-produktion (t. ex. lägga fibroblast-stimulerande tillväxtfaktorer).
Matriser kan genereras med förevigade fibroblaster eller primära fibroblast kulturer. Fibroblaster är lätta att underhålla i in vitro-kultur med en hög tillväxttakt och stresstålighet. De kan även isoleras från obduktion vävnad3, även om kontaminering kan vara en begränsning, beroende på vävnadens ursprung.
3D-Matrix-modellen här erbjuder ett nytt och effektivt system för att framgångsrikt studera ECM sammansättning och fiber orientering. Det är ocks…
The authors have nothing to disclose.
Utvecklingen av detta protokoll stöddes av PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 och RD12/0036/0041 från Instituto de Salud Carlos III; av Fondo Europeo de Desarrollo regional (FEDER); genom “CIBER de Cáncer”, CB16/12/00273 och CB16/12/00446, från Instituto de Salud Carlos III-FEDER; och av Fundación Científica AECC (en mångfacetterad strategi för att rikta pankreascancer). Cristina Peña är mottagare av ett Miguel Servet kontrakt från Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude hjälpte till med den engelska texten. Vi tackar Lab-medlemmar för hjälp och råd genom denna forskning.
Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
Triton X100 | Roth | 3051 | |
Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |