Drosophila fly muskelen er en kraftfull modell for å studere transcriptional regulering, alternative skjøting, metabolisme, og mechanobiology. Vi presenterer en protokoll for Disseksjon av fluorescerende-merket fly muskelen fra live pupae å generere svært beriket prøver ideell for Proteomikk og dyp-sekvensering. Disse prøvene kan tilby viktig mekanistisk innsikt i ulike aspekter av muskelutvikling.
Drosophila Flight muskelen er en kraftfull modell for å studere ulike prosesser som transcriptional regulering, alternative skjøting, metabolisme, og mechanobiology, som alle påvirker muskelutvikling og myofibrillogenesis. Omics data, slik som de som genereres av masse massespektrometri eller dype sekvensering, kan gi viktig mekanistisk innsikt i disse biologiske prosesser. For slike tilnærminger, er det fordelaktig å analysere vev-spesifikke prøver å øke både selektivitet og spesifisitet av omics fingeravtrykk. Her presenterer vi en protokoll for Disseksjon av fluorescerende-merket fly muskelen fra live pupae å generere svært beriket muskel prøver for omics applikasjoner. Vi for det første beskrive hvor å analysere flyreise muskelen for tidlig puppestadiet scener ( 48 h APF) eller voksen, når muskelen er gjenkjennelig under en dissekere mikroskop. Den med følgende video protokollen vil gjøre disse teknisk krevende dissections mer allment tilgjengelig for muskel-og Drosophila forskningsmiljøer. For RNA-programmer, analysen vi mengden og kvaliteten av RNA som kan isoleres på ulike tidspunkter og med ulike tilnærminger. Vi viser videre at Bruno1 (Bru1) er nødvendig for et timelig skifte i myosin tunge kjeden (MHC) skjøting, viser at dissekert musklene kan brukes til MRNA-SEQ, masse massespektrometri, og omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) Programmer. Denne disseksjon protokollen vil bidra til å fremme vev-spesifikke omics analyser og kan generelt anvendes for å studere flere biologiske aspekter av myogenesis.
Moderne omics teknologi gir viktig innsikt i muskelutvikling og mekanismene underliggende menneskelige muskellidelser. For eksempel, analyse av transcriptomics data kombinert med genetisk og biokjemiske verifisering i dyremodeller har avdekket at tap av skjøting faktor RBM20 årsaker utvidede kardiomyopati på grunn av sin regulering av et målnettverk av mer enn 30 sarkomerlengde gener som tidligere er assosiert med hjertesykdom, inkludert titin1,2,3.
I et annet eksempel har studier fra cellekultur, dyremodeller og menneskelige pasienter vist at myotonisk dystrofi skyldes en forstyrrelse i RNA-regulering på grunn av opptak av Muscleblind (MBNL) og oppregulering av CELF14,5. Korset-regulatoriske og timelige dynamikk mellom MBNL og CELF1 (også kalt CUGBP1 eller Bruno-like 2) bidra til å forklare vedvarende embryonale skjøting mønstre i myotonisk dystrofi pasienter. I tillegg bidrar det store nettverket av misregulated mål å forklare komplekse natur av sykdommen4,6,7,8. Et flertall av slike studier benytte omics tilnærminger i genetisk modell organismer å forstå mekanismene underliggende menneskelige muskel sykdom. Videre understreker de viktigheten av første forståelse Temporal og vev-type spesifikke genuttrykk, protein modifikasjon, og metabolske mønstre i sunn muskel å forstå endringer i syke eller aldrende muskel.
Drosophila melanogaster er en annen veletablert genetisk modell organisme. Strukturen av sarkomerlengde så vel som individuelle sarkomerlengde komponenter er svært bevart fra fluer til virveldyr4,10, og den indirekte fly musklene (IFMs) har blitt en kraftig modell for å studere flere aspekter av muskelutvikling11,12. Først fibrillær fly musklene er funksjonelt og morfologisk forskjellig fra rørformede kroppen musklene11,13, tillater gransking av muskel-type spesifikke utviklingsmessige mekanismer. Transkripsjon faktorer inkludert Wolframs store (Salm)14, Extradenticle (EXD), og Homothorax (HTH)15 har blitt identifisert som fibrillær skjebne regulatorer. I tillegg, nedstrøms av Salm, den CELF1 homologe Bruno1 (Bru1, året) dirigerer en fibrillær-spesifikk skjøting program16,17.
For det andre, IFMs er en viktig modell for å forstå prosessen med myogenesis seg selv, fra myoblast fusjon og myotube vedlegg til myofibrillogenesis og sarkomerlengde modning9,18,19. Tredje, Drosophila genetikk tillater gransking av bidrag fra individuelle proteiner, protein domener, og protein isoformene til sarkomerlengde formasjon, funksjon, og Biofysiske egenskaper20,21,22 ,23. Endelig, IFM modeller har blitt utviklet for studiet av flere menneskelige muskellidelser, som myotonisk dystrofi, myofibrillære myopatier, muskel degenerative lidelser, actinopathies, etc.24,25,26 ,27, og har gitt viktig innsikt i sykdoms mekanismer og potensielle terapier28,29,30. Således, Drosophila er en nyttig modell for å løse mange åpne spørsmål i myogenesis feltet, inkludert mekanismer av muskel-type spesifikk transkripsjon, skjøting, og kromatin regulering, samt til rollen som metabolisme i muskelutvikling. Anvendelsen av moderne omics teknologier, spesielt i kombinasjon med det store utvalget av genetiske, biokjemiske og celle biologiske analyser tilgjengelig i Drosophila, har potensial til å dramatisk fremme forståelsen av muskel utvikling, aldring og sykdom.
IFMs er de største musklene i fly, som spenner over nesten 1 mm over hele lengden av thorax i voksne31,32. Imidlertid genererer denne lille størrelsen utfordringen med å skaffe nok prøve å anvende omics teknologier i Drosophila i en vev-type spesifikk måte. Videre er IFMs en del av den voksne muskulaturen som dannes under puppestadiet etapper. Myoblasts sikring å danne myotubes, som festes til sener rundt 24 h etter puparium formasjon (APF) og gjennomgår en komprimerings trinn nødvendig å initiere myofibrillogenesis rundt 30 h APF (figur 1a-D)18,33, i 34.
Den myofibers deretter vokse til span hele lengden av thorax, med myofibrils gjennomgår en innledende vekstfase fokusert på sarkomerlengde tillegg til ca 48 h APF, og deretter overgangen til en modnings fase, der sarcomeres vokse i lengde og bredde og er ombygd for å etablere stretch-aktivering av 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Utbruddet av fiber modning er minst delvis kontrollert av Salm og E2F32,36,37, og flere IFM-spesifikke sarkomerlengde protein isoformene hvis skjøting styres av Bru1 er innarbeidet i løpet av denne Phase16,17. Modne fluer Eclose fra 90-100 h APF. Dette betyr at for å studere muskelutvikling, IFM må isoleres med tilstrekkelig mengde, kvalitet og renhet fra flere puppestadiet tidspunkter å forenkle analyse ved hjelp av omics tilnærminger.
Flere protokoller for IFM disseksjon har blitt publisert. Selv om disse protokollene fungerer bra for de tiltenkte applikasjonene, er ingen ideelle for omics tilnærminger. Protokoller som bevarer IFM morfologi for immunofluorescence av puppestadiet og voksne IFMs19, isolere IFM fibre for mekanisk evaluering31, eller utnytte microdissection av puppestadiet IFM fra cryosections38 er for spesialisert og tid og arbeidsintensiv til rimelig å få tilstrekkelige mengder IFM vev for omics applikasjoner. Andre protokoller er utviklet for rask Disseksjon av spesifikt voksen IFM38,39, således ikke gjelder for puppestadiet stadier, og bruke buffere som ikke er ideelle eller kan være uforenlig med for eksempel RNA isolasjon. Dermed er det behov for å utvikle nye tilnærminger for å isolere puppestadiet IFM for biokjemi eller omics applikasjoner.
Her presenterer vi en protokoll for Disseksjon av IFM under puppestadiet stadier som har blitt brukt med hell for mRNA-SEQ analyse fra 16 h APF gjennom voksen etapper16,32. Protokollen sysselsetter en grønn fluorescerende protein (GFP) etikett for å identifisere IFMs på alle stadier av puppestadiet og voksen utvikling, slik at Live disseksjon under et fluorescerende dissekere mikroskop. Tilnærmingen er mindre arbeidskrevende, med en høyere gjennomstrømning enn eksisterende IFM disseksjon protokoller. Dette gir rask isolering og kryonisk bevaring av prøver, genererer nok materiale etter flere runder med disseksjon for omics tilnærminger så vel som for standard omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) eller vestlig blotting.
Vi presentere protokollen i to deler, demonstrere hvordan du raskt analysere IFMs både før 48 h APF (under tidlig forvandling, når IFM vedlegg er mer spinkel) og etter 48 h APF (når puppestadiet kroppen plan og IFM vedlegg er godt definert). Vi viser at vi kan isolere høy kvalitet RNA fra dissekert IFMs på alle tidspunkter og presentere data på ulike tilnærminger til RNA isolasjon og omvendt transkripsjon. Til slutt viser vi anvendelsen av disseksjon protokollen til mRNA-SEQ, Mass massespektrometri, og RT-PCR ved hjelp av CELF1 homologe Bruno1 som et eksempel. Vi viser misexpression av sarkomerlengde protein isoformene i Proteomikk data fra Bruno1 mutant IFM og undersøke Bruno1 regulering av C-terminalen skjøte tilfelle myosin tung kjede (MHC). Disse resultatene illustrerer hvordan omics data kan gi en dypere forståelse av biologiske fenomener, utfyller genetiske og biokjemiske eksperimenter.
Inne denne protokollen, vi gave det grunn-teknikk å analysere Drosophila IFMs fra tidlig og sen-scene pupae for nedstrøms isolasjon av PROTEIN, DNA, RNA eller annet makromolekyler. Protokollen kan enkelt tilpasses til å analysere IFM fra voksen fluer. Vi viser nytten av vår disseksjon-protokoll for mRNA-SEQ-, Proteomikk-og RT-PCR-applikasjoner. Med kontinuerlig forbedring av omics teknologier for å muliggjøre analyse av prøver med mindre Start materiale og lavere inn data konsentrasjoner, vil disse dissections trolig bli verdifulle for mange tilleggsprogrammer. Som IFMs er en etablert modell for Human myopatier4,24 og muskel-type spesifikk utvikling9,12, vi ser for eksempel, IFM-beriket Plantemetabolomikk, undersøkelser av kromatin konformasjon via 3C eller 4C, skjøting nettverks evaluering via CLiP interaksjoner eller fosfat-Proteomikk av myofibrillogenesis.
Det er viktig å tenke på at disse dissections produsere en prøve beriket for IFM stedet for en ren IFM prøve. Dette er uunngåelig på grunn av motorisk Nevron innervasjon, sene vedlegg og tracheal invasjon av muskelfibre. Bioinformatikk analyse kan brukes til å identifisere IFM beriket gener eller proteiner, men ytterligere eksperimenter er nødvendig for å demonstrere at de faktisk er IFM-spesifikke. Sample renhet kan være analyseres ved hjelp av publiserte vev-spesifikke markører som stripe45 (sene),Act79B 4,44 (rørformede muskelen), Act88F15 (IFM), eller Syb46 (neuronal spesifikke). Det kan være mulig å bruke slike markører for å normalisere datasett til IFM-spesifikt innhold, men brukere advares om at timelige endringer i uttrykk for gener som brukes til normalisering, for eksempel av IFM-spesifikke gener eller tubulin, kan være en slik tilnærming.
Genetisk kodet vev-spesifikke merkings metoder, for eksempel EC-tagging47,48 eller PABP-merking49,50 for å isolere RNA har blitt utviklet i de senere år, noe som kan bidra til å oppnå en virkelig av en vevs spesifikk RNA-prøve. Men EC-merking krever konstant mating av fluer47 og dermed ikke er aktuelt under puppestadiet stadier. Følsomheten og fullstendigheten av PABP-merket transcriptomes kan ha begrensninger51. FACS tilnærminger for å isolere enkelte muskelfibre er komplisert av den store størrelsen og syncytial natur IFMs. Intakt52,53 stil tilnærminger kan brukes til å isolere spesifikke subcellulære-rom fra IFMs, som kan være nyttig for å isolere rene populasjoner av IFM kjerner eller mitokondrier. Manuell dissections er fortsatt gjeldende standard for å oppnå intakt IFM vev for de fleste nedstrøms applikasjoner.
Prøvekvaliteten avhenger av flere kritiske trinn i disseksjon prosessen. Dissections er teknisk krevende, med disseksjon hastighet og prøve renhet som øker med erfaring. Dissekere for korte perioder (20-30 min) i kjølt buffer uten vaskemiddel og umiddelbart frysing bidrar til å bevare prøve integritet, som har vært observert tidligere for musen sene isolasjon54. IFMs kan med hell tørr-frosset etter fjerner alle buffer fra pellet, men spesielt for RNA isolasjon, fryser prøver i isolasjon buffer har en tendens til å gi bedre resultater. IFMs fra opptil 20 separate dissections kombineres før RNA eller protein isolering, slik at skalering opp og samle nok materiale, selv fra tidlig tidspunkter eller mutanter16,32, for nedstrøms analyse.
For RNA-programmer kan det mest kritiske trinnet være isolering av RNA-en selv. Guanidiniumklorid ammoniumthiocyanat – fenol-kloroform isolering (metode 1 ovenfor) overgår de fleste kommersielle settene som er testet og, som tidligere nevnt, er betydelig rimeligere55. Variasjonen observert i RNA isolering gir med kommersielle kits er i overensstemmelse med tidligere observasjoner56,57. Vi legger ytterligere glykogen under isopropanol nedbør for å hjelpe gjenopprette alle RNA. Utover RNA-utbyttet er det viktig å verifisere RNA-integriteten for å sikre at prøven ikke har blitt fragmentert eller degradert under disseksjon-og isolasjons prosessene. Det er også viktig å jobbe RNase-Free. Endelig, valg av RT-Kit kan påvirke følsomheten til den omvendte transkripsjon prosessen. Selv om det ikke ofte diskutert i detalj, alle disse punktene påvirke kvaliteten på IFM prøven og data innhentet fra nedstrøms applikasjoner.
Flere viktige modifikasjoner sette protokollen bortsett fra eksisterende IFM disseksjon protokoller. Selv om en detaljert disseksjon protokoll for IFM immunofluorescence eksisterer19, denne protokollen presenterer en annen tilnærming til puppestadiet dissections som gjør at mer rask isolering av IFM vev. Dette gjør det mulig samling av store mengder IFM vev (relativt sett) med begrenset disseksjon ganger for å hindre proteom eller transcriptome endringer. Andre protokoller beskriver Disseksjon av voksen IFM for visualisering GFP farging i individuelle myofibrils39 eller for farging av larvestadiet Body-wall muskler58, men de ikke ta disseksjon på puppestadiet stadier eller for isolering av RNA eller protein. Denne tilnærmingen er også forskjellig fra den eksisterende protokollen for microdissection av puppestadiet IFMs fra cryosections38, som kan generere en renere IFM prøve, men er mer arbeidsintensiv og produserer mindre materiale. I forhold til andre raske voksne IFM disseksjon protokoller38,39, IFMs er isolert i PBS buffer uten vaskemiddel å begrense stress induksjon og andre store uttrykk endringer.
Nøkkelen forhånd i denne protokollen er inkluderingen av en live, fluorescerende reporter, slik isolering av IFMs ved tidlig puppestadiet stadier. Vi Standardly bruke Mef2-GAL459 kjører enten UAS-CD8:: GFP eller UAS-GFP:: GMA60. Dette gjør at differensial merking av IFM (fly musklene er sterkere merket og annerledes formet enn andre puppestadiet muskler) samt ytelse av GAL4-UAS-baserte manipulasjoner, for eksempel redning eller RNAi eksperimenter. Det er også mulig å kombinere Mef2-GAL4 med badekar-GAL80TS å unngå RNAi-assosiert tidlig dødelighet eller med UAS-Dcr2 å øke RNAi effektivitet40.
Der er i tillegg GAL4 sjåførene eller GFP-linjer anvendelig det variere inne muskelen-type spesifisitet, Temporal gjengivelsen mønster, og sjåfør styrke19,61 det kanskje bli brukt istedet for Mef2-GAL4. For eksempel er Act88F-GAL4 først uttrykt rundt 24 h APF, slik at den ikke kan brukes til tidligere tidspunkter; men det sterkt etiketter IFM og kan være nyttig for å unngå RNAi-assosiert tidlig dødelighet. Ham-GFP eller Act88F-GFP Label IFM, igjen med timelige restriksjoner, men de unngår GAL4 avhengighet av markør uttrykk og kan være nyttig i kombinasjon med en mutert bakgrunn av interesse. Lister over andre mulige markerings linjer er tilgjengelige19. Det bør også bemerkes at bruk av transgenes og GAL4/UAS systemet kan forårsake genuttrykk gjenstander, så det er viktig å bruke egnede kontroller, for eksempel sjåføren linjen krysset til vill-type bakgrunn belastning, slik at slike gjenstander er antagelig det samme i alle prøvene.
Med den med følgende videoen, denne detaljerte protokollen tar sikte på å gjøre puppestadiet IFM disseksjon mer tilgjengelig og fremme bruken av omics tilnærminger for å studere muskelutvikling. Kobling kraften i Drosophila genetikk og cellebiologi med biokjemi og omics analyser tilgjengelig gjennom dissekert IFM har potensial til å fremme mekanistisk forståelse av myogenesis og muskel funksjon. Fremtidige studier knytte systemer-nivå observasjoner av transcriptome og proteom regulering til metabolske og funksjonelle utganger vil gi en dypere forståelse av muskel-type spesifikk utvikling og patogenesen av muskellidelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Andreas Ladurner og Frank Schnorrer for generøs støtte. Vi takker Sandra Esser for utmerket teknisk assistanse og Akanksha Roy for generering av massen massespektrometri data. Vi erkjenner Bloomington og Wien lager sentre for å gi fluer. Vi takker Core Facility Bioimaging for hjelp med konfokalmikroskopi Imaging og Zentrallabor für Proteinanalytik for analyse av masse massespektrometri prøver, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, DE). Vårt arbeid ble støttet av Deutsche Forschungs gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated protein Science Munich (CIPSM) ved Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS), og den internasjonale Max Planck Research School (EN).
5x High Fidelity (HF) buffer | Thermo Fisher | F518L | |
60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
black dissecting dish (glass) | Augusta Laborbedarf | 42021010 | Lymphbecken, black glass, 4×4 cm |
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder | Sigma-Aldrich | C9157 | Also available from most pharmacies |
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes). |
blue pestle | Sigma-Aldrich | Z359947-100EA | Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder |
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
chloroform | PanReac AppliChem | A3691,0500 | |
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal | Leica | www.leica-microsystems.com | |
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal | Zeiss | www.zeiss.com | |
double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip |
EtOH (100%, RNase free) | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’. |
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
microtome blades | PFM Medical | 207500003 | C35 feather 80mm |
Monarch DNase I | New England Biolabs | T2004-21 | |
Monarch DNase I Reaction Buffer | New England Biolabs | T2005-21 | |
normal goat serum | Thermo Fisher | 16210072 | |
OneTaq Polymerase | New England Biolabs | M0480X | |
Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Fisher | F-530XL | |
Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
Preomics iST 8x Kit | Preomics | P.O.00001 | peptide preparation kit for mass spectrometry |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | 725500 | mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center |
Qubit RNA Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen, Molecular Probes | 10063052 | |
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
RNA Pico Chips | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
RNase A | Promega | A7937 | |
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
slide mounting buffer, Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | containing DAPI |
statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |