השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה
Summary
ברור גרורות תא כליות קרצינומה של תאים היא מחלה ללא מודל בעל חיים כולל לחקירה יסודית מראש. פרוטוקול זה ממחיש שני מודלים של בעלי חיים חדשניים עבור המחלה: מודל העכבר המושתל אורתולמריחה ומודל ממברנה של עוף כוראלואלי, שניהם הפגינו גרורות בריאות הדומה למקרים קליניים.
Abstract
ברור גרורות תא הכליה קרצינומה של תאים (ccRCC) הוא סוג המשנה הנפוץ ביותר של סרטן הכליה. CcRCC מקומי יש תוצאה כירורגית חיובית. עם זאת, שליש מהחולים ccRCC יפתחו גרורות לריאות, אשר קשורה לתוצאה גרועה מאוד עבור חולים. למרבה הצער, אין טיפול זמין בשלב זה קטלני, כי המנגנון המולקולרי של גרורות נשאר ידוע. זה ידוע במשך 25 שנים כי אובדן הפונקציה של פון היפפל-ינדאו (VHL) גן מדכא הגידול הוא pathognomonic של ccRCC. עם זאת, לא נוצר מודל העכבר הטרנסגניים רלוונטי קלינית של ccRCC. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג ולהשוות שתי מודלים בעלי חיים שהוקמו לאחרונה עבור ccRCC גרורתי. הראשון הוא השתלת כליות במודל העכבר. במעבדה שלנו, המערכת לעריכת גנים CRISPR היה מנוצל כדי להפיל את הגן VHL בכמה קווי תא RCC. אורתוקרט השרשה של אוכלוסיות ccRCC הטרוגנית לקפסולה כליות יצרה מודלים ccRCC הרומן לפתח גרורות ריאות חזקה בעכברים המוסמכת. המודל השני הוא מערכת קרום כוראלואלי של עוף (CAM). בהשוואה למודל העכבר, מודל זה הוא יותר זמן, עבודה, וחסכוני. מודל זה תמך גם היווצרות הגידול חזק ומלא. בשל הקצר 10 תקופה של גידול הגידול ב CAM, לא גרורות גלוי נצפתה על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) ברקמות העובר שנאספו. עם זאת, כאשר גידול הגידול הוארך על ידי שבועיים בעוף מקווקו, מיקרומטר נגעים ccRCC נצפו על ידי IHC בריאות. אלה שני דגמים מראש רומן קליני יהיה שימושי כדי ללמוד עוד מנגנון מולקולרי מאחורי גרורות, כמו גם להקים חדש, החולה נגזר xenografts (PDXs) לקראת פיתוח של טיפולים חדשניים עבור ccRCC גרורתי.
Introduction
קרצינומה של תאי הכליה (RCC) הואהסרטן הנפוץ ביותר 7 בארצות הברית. מדי שנה, 74,000 אמריקאים מוערך להיות שאובחנו לאחרונה, חשבונאות עבור יותר מ 14,000 מקרי מוות (ברור תא משנה היסטולוגית, או ccRCC, הוא סוג המשנה הנפוץ ביותר, חשבונאות עבור כ 80% של מקרים RCC. חולים עם ממאירות מותאמים לשפות אחרות מטופלים עם כריתת הנפרוטומיה ויש להם שיעור חיובי הישרדות 5 שנים של 73%1. עם זאת, 25%-30% מהחולים לפתח גרורות רחוקות איברים חיוניים כגון הריאות, וכתוצאה מכך הישרדות עני מרושע של 13 חודשים ושיעור ההישרדות של 5 שנים של רק 11%1,2,3. הבנה נוספת של מנגנון גרורתי נדרש כדי לשפר את התוצאה הקטלנית של ccRCC גרורתי.
ההפסד של הגן מדכא סרטן vhl הוא נגע גנטי החותם נצפתה ברוב של מקרים האדם ccrcc4,5,6,7. עם זאת, המנגנון האונגניים המדויק של אובדן VHL ב-ccRCC אינו ידוע. כמו כן, מצב ביטוי VHL אינו ניבוי של תוצאה ב-ccRCC8. בעיקר, למרות ניסיונות רבים על הכליה-אפיתל-המיקוד VHL ממוקד, מדענים לא הצליחו ליצור חריגות כליות מעבר לנגעים פיברוזיס preneoplastic נצפתה בעכברים9, גם כאשר בשילוב עם מחיקה של דכאי גידול אחרים כגון pten ו p5310. ממצאים אלה תומכים ברעיון כי הפסד VHL לבד אינו מספיק עבור tumorigenesis או גרורות ספונטנית הבאים.
לאחרונה, המעבדה שלנו יצרה הסתרה vhl חדש (vhl-KO) קו התא באמצעות מחיקת crispr/Cas9 בתיווך של הגן vhl ב-murine vhl ושקו התא (renca, או vhl-WT)11,12. הראנו כי VHL-KO היא לא רק mesenchymal, אלא גם מקדם את האפיתל למעבר mesenchymal (פרמדיק) של VHL-WT תאים12. חובש ידוע לשחק תפקיד חשוב בתהליך גרורתי13. העבודה שלנו עוד הראה כי גרורות ריאה מרחוק מתרחשת רק עם השרשה של VHL-KO ו VHL-WT תאים בכליה, תמיכה מנגנון שיתופי של גרורות. חשוב לעשות זאת, הדגם VHL-KO המושתל שלנו, והמודל VHL-WT שלנו, מוביל לגרורות ריאות חזקות, ובכך מופקת את התיקים הקליניים של ccRCC. המודל הספונטני הזה של ccRCC מפצה על חוסר מודל העכבר הגרוגני הטרנסגניים, במיוחד בפיתוח של תרופות נגד גרורות הרומן. פרוטוקול זה מדגים את ההשתלה קפסולת הכליות של אוכלוסיות תאים הטרוגנית של תאי RENCA הנדסה גנטית.
עוף פקה מודלים יש היסטוריה ארוכה במחקר על אנגיוגנזה וביולוגיה של הגידול בשל היתרונות הרבים שלהם, כפי שמסוכם בטבלה 114,15,16,17,18. בקצרה, חלון הזמן עבור צמיחה הגידול פקה קצר, המאפשר מקסימום של 11 ימים עד מצלמת הושמדה על ידי בקיעה של עוף16. למרות זמן הצמיחה הקצר, אספקת התזונה העשירה והמצב החיסוני של העובר העופות מאפשרים הגידול היעיל מאוד בתאום16,19,20,21. לבסוף, העלות של כל ביצה מופרית היא ~ $1, לעומת מעל $100 עבור העכבר SCID. יחד, מודל מצלמת יכול לשמש כמודל בעלי ערך חלופי בעלי חיים בהקמת PDXs חדש בחיסכון גדול בזמן ועלות בהשוואה לעכבר. בפרוטוקול זה, אנו העריכו אם המודל היה מסוגל ללכוד את הביולוגיה של ccRCC גרורתי שנצפו במודל העכבר הנושא אורתוקרט.
| (SCID) עכבר | צלמת | הערה | |
| עלות | > 100 דולר לכל | ~ $1 כל | הכדאיות החל מ 50-75% |
| הצורך בדיור מחסום | כן | לא | עוד מפחית עלות & מפשט ניטור סדרתי של גידולים |
| הגידול נראה ישירות | לא | כן | איור 3A |
| הזמן לחרט הראשון (RENCA) | 2 שבועות | 2-4 ימים | שופט 14, 15 |
| נקודת השיא של הצמיחה (RENCA) | 3-6 שבועות | 10 ימים | שופט 14, 15 |
| גרורה (RENCA) נצפתה | כן | כן אצל אפרוחים | איור 3D |
| מעברים סידוריים | כן | כן | 16-18 שופט |
| מעבר לעכברים (RENCA) | כן | כן | הו, ג’יי, ואח ‘ ביקורת (2019) |
| לשמור על טרוגניות הגידול | כן | כן | הו, ג’יי, ואח ‘ ביקורת (2019) |
טבלה 1: יתרונות ומגבלות של העכבר ומודלים קאם. הטבלה הזאת משווה בין שני המודלים ליתרונות ולמגבלות שלהם במונחים של זמן, עלות, עבודה וביולוגיה. מודל CAM יש יתרונות ביעילות, אבל יש לו גם מגבלות ייחודיות משלה בשל המבנה השונים בין ציפורים ויונקים. לכן, חשוב לאשר כי המודל יכול לשמור על ביולוגיה של שתלי xenografts
Protocol
Representative Results
Discussion
עבור חולים רבים עם ממאירות אפיתל, גרורות לאיברים חיוניים הוא הגורם העיקרי לתמותה. לכן, חיוני למצוא את המנגנון הבסיסי ואת השדרה החדשה של טיפול במחלה גרורתית. למרבה הצער, יש היעדר מודלים של בעלי חיים מגרורתי הרלוונטיים. האתגר בחלק הגדול נובע מחוסר יכולת לשחזר ccrcc בעכברים למרות הדור של כליות ה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הזאת ממומנת על ידי מענק הזרע JCCC באוניברסיטת ucla, המענק 3R של ucla, UCLA CTSI, ו-UC TRDRP (LW). אנו מודים למכון לדימות מראש של מכון Crump, TPCL, ו-UCLA של מחלקת רפואת בעלי חיים במעבדה (DLAM) על עזרתם בשיטות נסיוניות. Cy, הזרמת מחלות של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג’לס (JCCC) והמרכז לחקר האיידס של מכון המחקר Cy, הנתמך על ידי מכונים לאומיים של פרסי בריאות P30 CA016042 ו 5P30 AI028697, ועל ידי JCCC, מכון האיידס של UCLA, בית הספר לרפואה ע ש דויד גפן באוניברסיטת קליפורניה, משרד הקנצלר של UCLA, ומשרד המחקר של סגן הנשיא באוניברסיטת ucla. שירותי ייעוץ וניתוח נתונים לסטטיסטיקה סופקו על ידי תוכנית ביוסטטיסטיקה, אפידמיולוגיה ותכנון מחקר (BERD) הנתמכת על ידי NIH/המרכז הלאומי לקידום מדעי המדינה באוניברסיטת UCLA מספר UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
