مقارنة النقيلي واضحة خلية الخلايا الكلوية نموذج سرطان الخلايا المنشأة في الكلى الماوس وعلى غشاء Chorioallantoic الدجاج
Summary
سرطان الخلايا الكلوية النقيلي ة الخلايا هو مرض دون نموذج الحيوان شاملة للتحقيق الشامل قبل السريرية. يوضح هذا البروتوكول نموذجين جديدين للحيوانات لهذا المرض: نموذج الماوس المزروع تقويمًا للموضع ونموذج غشاء الدجاج chorioallantoic ، وكلاهما يوضح انبثاث الرئة يشبه الحالات السريرية.
Abstract
سرطان الخلايا الكلوية النقيلية (ccRCC) هو النوع الفرعي الأكثر شيوعًا لسرطان الكلى. ccRCC المترجمة لديها نتيجة جراحية مواتية. ومع ذلك ، فإن ثلث مرضى CCRCC تطوير الانبثاث إلى الرئة ، والتي ترتبط نتيجة سيئة للغاية للمرضى. لسوء الحظ ، لا يتوفر علاج لهذه المرحلة القاتلة ، لأن الآلية الجزيئية للانبثاث لا تزال غير معروفة. ومن المعروف منذ 25 عاما أن فقدان وظيفة فون هيبل لينداو (VHL) ورم الجين مثبط هو pathognomonic ccRCC. ومع ذلك، لم يتم إنشاء أي نموذج الماوس المعدلة وراثيا ذات الصلة سريريا من CCRCC. والغرض من هذا البروتوكول هو إدخال ومقارنة نموذجين للحيوانات المنشأة حديثا لCCRCC النقيلي. الأول هو زرع الكلى في نموذج الماوس. في مختبرنا، تم استخدام نظام تحرير الجينات CRISPR لضرب جين VHL في العديد من خطوط الخلايا RCC. زرع تقويم العظام من مجموعات ccRCC غير متجانسة إلى كبسولة الكلى خلق نماذج CCRCC الرواية التي تطور نقائل الرئة قوية في الفئران الكفؤة المناعية. النموذج الثاني هو نظام غشاء الدجاج chorioallantoic (CAM). بالمقارنة مع نموذج الماوس ، وهذا النموذج هو المزيد من الوقت ، والعمل ، وفعالة من حيث التكلفة. كما دعم هذا النموذج تكوين الورم القوي والتلقيح. نظرًا لفترة الـ 10 أيام القصيرة لنمو الورم في CAM ، لم يلاحظ أي انبثاث ًا منحيث المناعة (IHC) في أنسجة الأجنة التي تم جمعها. ومع ذلك ، عندما تم تمديد نمو الورم لمدة أسبوعين في الدجاج المفقس ، لوحظت آفات ccRCC micrometastatic من قبل IHC في الرئتين. هذان النموذجان قبل السريريان الجديدان سيكونان مفيدين لمزيد من الدراسة للآلية الجزيئية وراء الانبثاث ، وكذلك لإنشاء xenografts الجديدة المشتقة من المريض (PDXs) نحو تطوير علاجات جديدة لCCRCC النقيلي.
Introduction
سرطان الخلايا الكلوية (RCC) هو السرطان 7الأكثر شيوعا في الولايات المتحدة. سنويا، يقدر أن يتم تشخيص 74،000 الأميركيين حديثا، وهو ما يمثل أكثر من 14،000 حالة وفاة (مسح الخلية النسيجية الفرعية، أو CCRCC، هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا، وهو ما يمثل ما يقرب من 80٪ من حالات RCC. يتم علاج المرضى الذين يعانون من خبيثة موضعية مع استئصال الكلية ولديهم معدل بقاء مناسب لمدة 5 سنوات من 73٪1. ومع ذلك ، فإن 25٪ -30٪ من المرضى يصابون بثًا بعيدًا بالأعضاء الحيوية مثل الرئتين ، مما يؤدي إلى ضعف متوسط البقاء على قيد الحياة لمدة 13 شهرًا ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات فقط 11٪1،2،3. هناك حاجة إلى مزيد من الفهم للآلية النقيلية لتحسين النتيجة القاتلة لCCRCC النقيلي.
فقدان الجين مثبط الورم VHL هو آفة وراثية مميزة لوحظت في غالبية الحالات CCRCC الإنسان4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن آلية oncogenic الدقيقة لفقدان VHL في CCRCC غير معروفة. أيضا، حالة التعبير VHL ليست تنبؤية من النتيجة في ccRCC8. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من المحاولات العديدة في الكلى الظهارية المستهدفة VHL بالضربة القاضية ، فشل العلماء في توليد شذوذ كلوي يتجاوز الآفات الكيسية preneoplastic التي لوحظت في الفئران9، حتى عندما يقترن حذف مثبطات الورم الأخرى مثل PTEN و P5310. تدعم هذه النتائج فكرة أن فقدان VHL وحده غير كافٍ لتكوين الورم أو الانبثاث التلقائي اللاحق.
في الآونة الأخيرة ، أنشأ مختبرنا خط ًا خلية VHL خروجًا المغلوب جديدًا (VHL-KO) باستخدام CRISPR/Cas9 بوساطة حذف جين VHL في خط خلية Min VHL + ccRCC (RENCA ، أو VHL-WT)11،12. أظهرنا أن VHL-KO ليس فقط mesenchymal ، ولكن أيضا يعزز الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) من خلايا VHL -WT12. ومن المعروف EMT للعب دور مهم في عملية النقيلي13. كما أظهر عملنا أن انبثاث الرئة البعيدة لا يحدث إلا مع الزرع المشترك لخلايا VHL-KO وVHL-WT في الكلى ، مما يدعم آلية تعاونية للانبثاث. الأهم من ذلك، لدينا زرع تقويم العظام VHL-KO وVHL-WT نموذج يؤدي إلى نقائل الرئة قوية، تلخيص الحالات ccCcCC السريرية. هذا النموذج التلقائي ccRCC النقيلي يعوض عن عدم وجود نموذج الماوس النقيلي المعدلة وراثيا، وخاصة في تطوير الأدوية الجديدة المضادة للانبثاث. يوضح هذا البروتوكول زرع الكبسولة الكلوية لتجمعات الخلايا غير المتجانسة لخلايا RENCA المعدلة وراثياً.
نماذج كام الدجاج لها تاريخ طويل في مجال البحث عن تولد الأوعية وبيولوجيا الورم بسبب مزاياها العديدة ، كما هو ملخص في الجدول 111،15،16،17،18. باختصار ، فإن النافذة الزمنية لنمو الورم CAM قصيرة ، مما يسمح بحد أقصى 11 يومًا حتى يتم تدمير CAM عند تفقيس الدجاج16. على الرغم من وقت النمو القصير ، فإن إمدادات التغذية الغنية وحالة نقص المناعة لجنين الدجاج تمكن من تطعيم الورم بشكل فعال للغاية16،19،20،21. وأخيرا ، فإن تكلفة كل البويضة المخصبة هو ~ 1 دولار ، مقارنة مع أكثر من 100 دولار لفأر SCID. معا ، يمكن لنموذج كام بمثابة نموذج الحيوان البديلة القيمة في إنشاء PDXs جديدة في توفير كبير في الوقت والتكلفة بالمقارنة مع الماوس. في هذا البروتوكول، قمنا بتقييم ما إذا كان النموذج قادرًا على تلخيص بيولوجيا CCRCC النقيلية التي لوحظت في نموذج تقويم العظام للفأرة.
| (SCID) الماوس | كام | ملاحظه | |
| تكلفه | > 100 دولار لكل منهما | ~ 1 دولار لكل منهما | قابلية البقاء تتراوح بين 50-75٪ |
| الحاجة إلى السكن الحاجز | نعم | لا | يقلل من التكلفة ويبسط المراقبة التسلسلية للأورام |
| الورم مرئية مباشرة | لا | نعم | الشكل 3أ |
| الوقت لتطعيم أول (RENCA) | أسبوعان | 2-4 أيام | المرجع 14، 15 |
| نقطة نهاية النمو (RENCA) | 3-6 أسابيع | 10 أيام | المرجع 14، 15 |
| الانبثاث (RENCA) لوحظ | نعم | نعم في الكتاكيت | الشكل 3D |
| مقاطع متسلسلة | نعم | نعم | المرجع 16-18 |
| المرور إلى الفئران (RENCA) | نعم | نعم | هو، ج.، وآخرون قيد المراجعة (2019) |
| الحفاظ على تغايرية الورم | نعم | نعم | هو، ج.، وآخرون قيد المراجعة (2019) |
الجدول 1: مزايا وقيود نماذج الماوس وCAM. يقارن هذا الجدول بين النموذجين لمزاياها وقيودها من حيث الوقت المطلوب والتكلفة والعمالة ، فضلا عن علم الأحياء. نموذج CAM له مزايا في الكفاءة، ولكن لديه أيضا قيود فريدة خاصة به بسبب مورفولوجيا مختلفة بين الطيور والثدييات. لذلك ، من المهم التأكيد على أن النموذج يمكن أن يحتفظ ببيولوجيا xenografts.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالنسبة للعديد من المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الظهارية ، فإن الانبثاث في الأعضاء الحيوية هو السبب الرئيسي للوفاة. لذلك ، من الضروري العثور على الآلية الأساسية ووسيلة جديدة للعلاج من الأمراض النقيلية. لسوء الحظ، هناك نقص في النماذج الحيوانية CCRCC النقيلية ذات الصلة. التحدي في جز?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل منحة البذور جامعة كاليفورنيا JCCC، منحة UCLA 3R، جامعة كاليفورنيا CTSI، وجامعة كاليفورنيا TRDRP (LW). نشكر مرفق التصوير قبل السريري التابع لمعهد كرومب، وTPCL، وقسم الطب الحيواني المختبري في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (DLAM) لمساعدتهم في الطرق التجريبية. تم إجراء قياس التدفق الخلوي في مركز السرطان الشامل في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس جونسون (JCCC) ومركز أبحاث الإيدز تدفق الخلوي مرفق الأساسية التي تدعمها المعاهد الوطنية للصحة جوائز P30 CA016042 و 5P30 AI028697، وJCCC، ومعهد الإيدز في جامعة كاليفورنيا، وكلية ديفيد جيفن للطب في جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس، ومكتب رئيس جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس، ومكتب جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس تم توفير خدمات الاستشارات الإحصائية وتحليل البيانات من قبل برنامج جامعة كاليفورنيا CTSI للإحصاءات الحيوية وعلم الأوبئة وتصميم الأبحاث (BERD) الذي يدعمه معهد الصحة القومي / المركز الوطني للنهوض بالعلوم المترجمة في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس CTSI رقم UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
