比较在小鼠肾脏和鸡胆膜上建立的转移性透明细胞肾细胞癌模型
1Department of Molecular and Medical Pharmacology,David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology,University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering,Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics,University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences,Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital,Sichuan University, 8Department of Urology,David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles
Summary
转移性透明细胞肾细胞癌是一种没有全面动物模型进行彻底临床前调查的疾病。该协议说明了该病的两种新型动物模型：正位植入小鼠模型和鸡胆膜模型，这两种模型都显示了类似临床病例的肺转移。
Abstract
转移性透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾癌最常见的亚型。本地化的ccRCC有良好的手术效果。然而，三分之一的ccRCC患者会发展为肺部转移，这与患者的不良结果有关。不幸的是，这个致命的阶段没有可用的治疗，因为转移的分子机制仍然未知。25年来，人们一直知道，冯·希佩尔-林杜（VHL）肿瘤抑制基因的功能丧失是ccRCC的病理性腺体。然而，尚未生成与临床相关的ccRCC转基因小鼠模型。该协议的目的是介绍和比较两个新建立的动物模型转移ccRCC。第一种是小鼠模型中的肾脏植入。在我们的实验室中，CRISPR基因编辑系统用于敲除多个RCC细胞系中的VHL基因。异质ccRCC种群的正交体植入肾脏胶囊创造了新的ccRCC模型，在免疫能力小鼠中形成强健的肺转移。第二个模型是鸡胆膜（CAM）系统。与鼠标模型相比，该模型更具有时间、更劳动、更经济性。该模型还支持强健的肿瘤形成和内脉化。由于CAM的肿瘤生长期短10天，免疫组织化学（IHC）在采集的胚胎组织中未观察到任何未出现转移。然而，当孵化鸡的肿瘤生长延长两周时，IHC在肺部观察到微转移性ccRCC病变。这两种新颖的临床前模型将有助于进一步研究转移背后的分子机制，以及建立新的患者衍生异种移植物（PDXs），以开发转移性ccRCC的新疗法。
Introduction
肾细胞癌（RCC）是美国第7大常见癌症。据估计，每年有74，000名美国人被新诊断，占14，000多人死亡（透明细胞组织学亚型，或ccRCC，是最常见的亚型，约占RCC病例的80%。局部恶性肿瘤患者接受肾切除术治疗，5年生存率为73%1。然而，25%-30%的患者发展到肺部等重要器官的远转移，导致13个月的平均存活率低，5年生存率仅为11%，1，2，3。需要进一步了解转移机制，以改善转移性ccRCC的致命结果。
VHL肿瘤抑制基因的丧失是大多数人类ccRCC病例4、5、6、7中观察到的一种特征遗传病变。然而，ccRCC中VHL损失的精确致癌机制尚不得而知。此外，VHL 表达式状态不能预测 ccRCC8中的结果。值得注意的是，尽管多次尝试肾上皮靶向VHL敲除，科学家未能产生肾脏异常，超越在小鼠9观察到的前皮性囊肿病变，即使结合删除其他肿瘤抑制剂，如PTEN和p5310。这些发现支持了这样一种观点，即仅VHL损失不足以进行肿瘤发生或随后的自发转移。
最近，我们的实验室使用CRISPR/Cas9介导的VHL基因在鼠VHL®ccRCC细胞系（RENCA，或VHL-WT）11、12中，创建了一个新的VHL挖空（VHL-KO）细胞系。研究表明，VHL-KO不仅是位位，而且促进VHL-WT细胞12的上皮到中位过渡（EMT）。众所周知，EMT在转移过程中起着重要的作用13。我们的工作进一步表明，距离性肺转移只有在肾脏中共同植入VHL-KO和VHL-WT细胞时才会发生，支持转移的合作机制。重要的是，我们的正位植入VHL-KO和VHL-WT模型导致强大的肺转移，重述临床ccRCC病例。这种自发转移ccRCC模型弥补了转基因转移小鼠模型的不足，特别是在新型抗转移药物的开发中。该协议演示了遗传工程RENCA细胞异质细胞群的肾胶囊植入。
鸡CAM模型在血管生成和肿瘤生物学的研究有很长的历史，由于其众多的优势，总结在表114，15，16，17，18。简单地说，CAM肿瘤生长的时间窗口很短，允许最多11天，直到CAM在孵化鸡16时被破坏。尽管生长时间短，鸡胚胎丰富的营养供应和免疫缺陷状态使非常有效的肿瘤移植16，19，20，21。最后，每个受精卵的成本为 1 美元，而 SCID 小鼠的成本超过 100 美元。与鼠标相比，CAM 模型可以一起作为建立新 PDX 的宝贵替代动物模型，在时间和成本上节省大量成本。在此协议中，我们评估了该模型是否能够重述在小鼠正交模型中观察到的转移性ccRCC生物学。
| （SCID）鼠标 | 凸轮 | 注意 | |
| 成本 | >$100 每个 | 每人 1 美元 | 生存能力从50-75% 不等 |
| 需要屏障住房 | 是的 | 不 | 进一步降低成本和简化肿瘤的序列监测 |
| 肿瘤直接可见 | 不 | 是的 | 图 3A |
| 第一次移植的时间（RENCA） | 2 周 | 2-4天 | 参考 14， 15 |
| 增长终点（RENCA） | 3-6 周 | 10 天 | 参考 14， 15 |
| 观察到的转移（RENCA） | 是的 | 是，在小鸡 | 图 3D |
| 串行通道 | 是的 | 是的 | 参考 16-18 |
| 传给老鼠（RENCA） | 是的 | 是的 | 胡先生等人正在审查（2019年） |
| 维持肿瘤异质性 | 是的 | 是的 | 胡先生等人正在审查（2019年） |
表1：鼠标和CAM型号的优点和局限性。此表比较了两种模型在所需时间、成本、人工和生物学方面的优势和局限性。CAM模型在效率上有优势，但由于鸟类和哺乳动物之间的形态不同，它也有其独特的局限性。因此，确认该模型可以保留异种移植物的生物学性非常重要。
Protocol
此处描述的所有方法均获得被指定为加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会 （ARC） （ARC 2002-049-53 和 ARC 2017-102-01A） 的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。2002-049-53 协议针对将 ccRCC 肿瘤细胞植入裸体或 BALB/c 小鼠的肾胶囊进行了优化。孵化前在受精鸡蛋中进行肿瘤植入实验不需要IACUC批准。为了延长肺转移的建立时间，允许带有CAM肿瘤的胚胎孵化和成长为鸡。2017-102-01A 协议涵盖这些动…
Representative Results
除非另有说明，否则每个实验至少进行3次。数据以均值 = 标准差 （SD） 的形式显示。当有两个组时，由配对的学生 T 测试或三个或更多组时的单向 ANOVA 确定显著性。使用 0.05 的 p 值截止来确定显著性。 正位植入的RENCA细胞在小鼠肾脏上成功生长，经BLI和H&E染色（图2A-B）证实。虽然原生生长…
Discussion
对于许多上皮恶性肿瘤患者来说，转移到重要器官是导致死亡的主要原因。因此，必须找到转移性疾病的基本机制和新的治疗途径。不幸的是，缺乏相关的转移ccRCC动物模型。挑战在很大程度上是由于无法在小鼠中重现ccRCC，尽管生成了无数转基因肾上皮靶向VHL淘汰小鼠模型9，10。在这里，我们演示了在小鼠和鸡CAM两个动物系统中建立可植入转移性ccRCC?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由加州大学洛杉矶分校JCCC种子赠款、加州大学洛杉矶分校3R赠款、加州大学洛杉矶分校CTSI和UC TRDRP（LW）资助。我们感谢克鲁普研究所的临床前成像设施、TPCL和加州大学洛杉矶分校实验室动物医学部（DLAM）在实验方法方面提供的帮助。流式细胞测量在加州大学洛杉矶分校约翰逊综合癌症中心 （JCCC） 和艾滋病研究流细胞学核心设施中进行，由美国国家卫生研究院颁发 P30 CA016042 和 5P30 AI028697 奖，并由 JCCC、加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所、加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院、加州大学洛杉矶分校校长办公室和加州大学洛杉矶分校副校长研究办公室支持。统计咨询和数据分析服务由加州大学洛杉矶分校CTSI生物统计学、流行病学和研究设计（BERD）计划提供，该计划由NIH/国家促进转化科学中心支持，加州大学洛杉矶分校CTSI授权号UL1TR001881。
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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Citer Cet Article
Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).