マウス腎臓と鶏絨毛性膜に確立された転移性透明細胞腎細胞癌モデルの比較
Summary
転移性透明細胞腎細胞癌は、徹底的な前臨床調査のための包括的な動物モデルのない疾患である。このプロトコルは、この疾患の2つの新しい動物モデルを示している:異所的に移植されたマウスモデルと鶏絨毛アラント膜モデルは、いずれも臨床症例に似た肺転移を示す。
Abstract
転移性透明細胞癌(ccRCC)は、腎臓癌の最も一般的なサブタイプである。局在ccRCCは、良好な外科的結果を有する。しかし、ccRCC患者の3分の1は肺への転移を発症し、これは患者にとって非常に悪い結果に関連する。残念ながら、転移の分子機構は不明のままであるため、この致命的な段階では治療法はありません。フォンヒッペル-リンダウ(VHL)腫瘍抑制遺伝子の機能の喪失はccRCCの病態である25年間知られている。しかし、ccRCCの臨床的に関連するトランスジェニックマウスモデルは生成されていない。このプロトコルの目的は、転移性ccRCCのための2つの新しく確立された動物モデルを紹介し、比較することです。1つ目はマウスモデルにおける腎移植である。当研究室では、CRISPR遺伝子編集システムを利用して、いくつかのRCC細胞株のVHL遺伝子をノックアウトしました。腎カプセルへの異種ccRCC集団の正体移植は、免疫担当マウスにおける堅牢な肺転移を発症する新しいccRCCモデルを作成した。2つ目のモデルは、鶏絨毛多対数膜(CAM)システムです。マウスモデルと比較して、このモデルはより多くの時間、労力、コスト効率が高い。このモデルはまた、堅牢な腫瘍形成および血管内形成を支持した。CAMにおける腫瘍増殖の10日間の短い期間のために、採取した胚組織において免疫組織化学(IHC)によってあからさしい転移は認められなかった。しかし、孵化した鶏で腫瘍増殖を2週間延長したところ、肺にIHCにより微小転移性ccRCC病変が観察された。これら2つの新しい前臨床モデルは、転移の背後にある分子機構をさらに研究し、転移性ccRCCの新規治療法の開発に向けて新しい患者由来異種移植片(PDX)を確立するのに役立つだろう。
Introduction
腎細胞癌(RCC)は、米国で7番目に多い癌である。毎年74,000人のアメリカ人が新たに診断されると推定され、14,000人以上の死亡を占めています(クリアセル組織学的サブタイプ(ccRCC)は最も一般的なサブタイプであり、RCC症例の約80%を占めています。局在性悪性腫瘍患者は腎摘出術で治療され、良好な5年生存率は73%1である。しかし、患者の25%〜30%が肺などの重要な器官への遠隔転移を発症し、13ヶ月の平均生存率が低く、5年生存率はわずか11%1、2、3である。転移性ccRCCの致命的な結果を改善するためには、転移機構をさらに理解する必要がある。
VHL腫瘍抑制遺伝子の喪失は、ヒトccRCC症例の大半で認められる特徴である遺伝的病変4、5、6、7である。しかし、ccRCCにおけるVHL損失の正確な発癌機構は不明である。また、VHL式の状態は、ccRCC8における結果の予測ではありません。特に、腎上皮標的VHLノックアウトで数多くの試みにもかかわらず、科学者たちは、PTENおよびp5310のような他の腫瘍抑制剤の欠失と組み合わせても、マウス9で観察された前生性嚢胞性病変を超えて腎異常を生成することができなかった。これらの知見は、VHLの損失だけでは腫瘍形成またはその後の自発的転移には不十分であるという考えを裏付けている。
最近、我々の研究室は、マウスVHL+ ccRCC細胞株(RENCA、またはVHL-WT)11、12におけるVHL遺伝子のCRISPR/Cas9媒介性欠失を用いて新しいVHLノックアウト(VHL-KO)細胞株を作成した。我々は、VHL−KOが間葉だけでなく、VHL−WT細胞12の間葉転換(EMT)への上皮移行(EMT)を促進することを示した。EMTは、転移プロセス13において重要な役割を果たすることが知られている。我々の研究はさらに、遠くの肺転移が腎臓におけるVHL-KO細胞およびVHL-WT細胞の共移植によってのみ起こり、転移の協調メカニズムを支持することを示した。重要なことに、当社の正体移植されたVHL-KOおよびVHL-WTモデルは、堅牢な肺転移をもたらし、臨床ccRCC症例を再現する。この自然転移性ccRCCモデルは、特に新しい抗転移薬の開発において、トランスジェニック転移性マウスモデルの欠如を補う。このプロトコルは、遺伝子組み換えRENCA細胞の異種細胞集団の腎カプセル移植を実証する。
鶏CAMモデルは、表114、15、16、17、18に要約されるように、その多くの利点のために血管新生および腫瘍生物学の研究において長い歴史を有する。簡単に言えば、CAM腫瘍成長のための時間枠は短く、鶏16の孵化時にCAMが破壊されるまで最大11日間を可能にする。短い成長時間にもかかわらず、鶏胚の豊富な栄養供給および免疫不全状態は、非常に効率的な腫瘍生着16、19、20、21を可能にする。最後に、SCIDマウスの場合は100ドルを超えるのに対し、各受精卵のコストは〜$1です。CAMモデルは、マウスと比較して時間とコストを大幅に節約し、新しいPDXを確立する上で貴重な代替動物モデルとして役立ちます。このプロトコルでは、マウスの正所モデルで観察された転移性ccRCCの生物学を再現できるかどうかを評価した。
| (SCID)マウス | カム | メモ | |
| コスト | >$100 各 | ~$1 各 | 50~75%の生存率 |
| バリアハウジングの必要性 | はい | いいえ | さらにコストを削減&簡単に腫瘍の連続監視 |
| 腫瘍は直接見える | いいえ | はい | 図 3A |
| 最初の生着までの時間(RENCA) | 2週間 | 2~4日 | ref 14, 15 |
| 成長のエンドポイント(RENCA) | 3-6週間 | 10日間 | ref 14, 15 |
| 転移(RENCA)観察 | はい | はいひよこで | 図 3D |
| シリアルパッセージ | はい | はい | ref 16-18 |
| マウスへの通路(レンカ) | はい | はい | Hu, J., らレビュー中 (2019) |
| 腫瘍の不均一性を維持する | はい | はい | Hu, J., らレビュー中 (2019) |
表 1: マウスモデルと CAM モデルの利点と制限この表は、必要な時間、コスト、労力、および生物学の面で、その利点と制限の2つのモデルを比較します。CAMモデルは効率の利点があるが、それはまた鳥と哺乳類の間の異なった形態による独特の限界がある。したがって、モデルが異種移植片の生物学を保持できることを確認することが重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
上皮性悪性腫瘍を有する多くの患者にとって、重要な器官への転移が死亡の主な原因である。したがって、転移性疾患の根本的なメカニズムと新しい治療法の道を見つけることが不可欠です。残念ながら、関連する転移性ccRCC動物モデルが不足しています。大部分の課題は、多数のトランスジェニック腎臓上皮標的VHLノックアウトマウスモデル9、10…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、UCLA JCCCシード補助金、UCLA 3R助成金、UCLA CTSI、およびUC TRDRP(LW)によって資金提供されました。私たちは、クランプ研究所の前臨床画像施設、TPCL、UCLAの実験動物医学部門(DLAM)が実験的方法に協力してくれたことに感謝します。フローサイトメトリーは、国立衛生研究所賞P30 CA016042および5P30 AI028697によって支援されているUCLAジョンソン総合がんセンター(JCCC)とエイズ研究フローサイトメトリーコア施設で行われ、JCCC、UCLAエイズ研究所、デビッド・ゲッフェン医学部、UCLA首相事務所、UCLA統計コンサルティングおよびデータ分析サービスは、NIH/国立トランスレーショナルサイエンス進歩センターUCLA CTSIグラント番号UL1TR001881によって支援されているUCLA CTSI生物統計学、疫学、および研究デザイン(BERD)プログラムによって提供されました。
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
