Jämföra metastaserande clear cell njurcellscancer modell etablerad i mus njure och på kyckling chorioallantoic membranet
Summary
Metastaserande klar cell njurcellscancer är en sjukdom utan en omfattande djurmodell för grundlig preklinisk undersökning. Detta protokoll illustrerar två nya djurmodeller för sjukdomen: den ortopediskt implanterade musmodellen och kycklingchorioallantoic membranmodellen, som båda visar lungmetastasering liknar kliniska fall.
Abstract
Metastaserande klar cell njurcellscancer (ccRCC) är den vanligaste subtypen av njurcancer. Lokaliserad ccRCC har ett gynnsamt kirurgiskt utfall. En tredjedel av ccRCC-patienter kommer dock att utveckla metastaser till lungan, vilket är relaterat till ett mycket dåligt resultat för patienterna. Tyvärr är ingen terapi tillgänglig för detta dödliga skede, eftersom den molekylära mekanismen för metastasering förblir okänd. Det har varit känt i 25 år att förlusten av funktion av von Hippel-Lindau (VHL) tumör suppressor genen är paognomonic av ccRCC. Ingen kliniskt relevant transgen musmodell av ccRCC har dock genererats. Syftet med detta protokoll är att införa och jämföra två nyetablerade djurmodeller för metastaserande ccRCC. Den första är njurimplantation i musmodellen. I vårt laboratorium användes CRISPR-genredigeringssystemet för att slå ut VHL-genen i flera RCC-cellinjer. Ortopediskt implantation av heterogena ccRCC populationer till njurkapseln skapade nya ccRCC modeller som utvecklar robusta lungmetastaser i immunkompetenta möss. Den andra modellen är kyckling chorioallantoic membranet (CAM) systemet. I jämförelse med musmodellen är denna modell mer tid, arbete och kostnadseffektiv. Denna modell stödde också robust tumörbildning och intravasation. På grund av den korta 10-dagarsperioden av tumörtillväxt i CAM observerades ingen överlig metastasering av immunohistochemistry (IHC) i de insamlade embryovävnaderna. Men när tumörtillväxt förlängdes med två veckor i den kläckta kycklingen observerades mikrometastaserande ccRCC-lesioner av IHC i lungorna. Dessa två nya prekliniska modeller kommer att vara användbara för att ytterligare studera den molekylära mekanismen bakom metastasering, samt att etablera nya, patienthärledda xenografts (PDXs) mot utvecklingen av nya behandlingar för metastaserande ccRCC.
Introduction
Renal cell carcinom (RCC) är den7: e vanligaste canceri USA. Årligen, 74.000 amerikaner beräknas vara nydiagnostiserade, står för mer än 14.000 dödsfall (Clear-cell histologiska subtyp, eller ccRCC, är den vanligaste subtyp, står för cirka 80% av RCC fall. Patienter med lokaliserad malignitet behandlas med nefrectomy och har en gynnsam 5-års överlevnad på 73%1. Men 25%-30% av patienterna utveckla avlägsna metastaser till vitala organ såsom lungorna, vilket resulterar i en dålig genomsnittlig överlevnad på 13 månader och 5-års överlevnad på endast 11%1,2,3. Ytterligare förståelse av metastaserande mekanismen behövs för att förbättra det dödliga resultatet för metastaserande ccRCC.
Förlusten av VHL tumör suppressor genen är ett kännetecken genetisk skada observeras i en majoritet av mänskliga ccRCC fall4,5,6,7. Den exakta oncogenic mekanismen för VHL förlust i ccRCC är dock okänd. Dessutom är VHL uttryckstatus inte förutsägande av resultatet i ccRCC8. Noterbart, trots många försök till renal-epitelial-riktade VHL knockout, forskare har misslyckats med att generera njurmedicinska onormala effekter utöver preneoplastic cystic skador observerats i möss9, även i kombination med radering av andra tumör suppressors såsom PTEN och p5310. Dessa fynd stöder tanken att Enbart VHL-förlusten är otillräcklig för tumorigenesis eller den efterföljande spontana metastasering.
Nyligen skapade vårt laboratorium en ny VHL knockout (VHL-KO) celllinje med CRISPR /Cas9 medierad borttagning av VHL genen i murine VHL + ccRCC cellinje (RENCA, eller VHL-WT)11,12. Vi visade att VHL-KO är inte bara mesenchymal, men främjar också epitel till mesenchymal övergång (EMT) av VHL-WT celler12. EMT är känt för att spela en viktig roll i metastaserande process13. Vårt arbete visade vidare att avlägsna lungmetastasering endast sker med co-implantation av VHL-KO- och VHL-WT-celler i njuren, vilket stöder en kooperativ mekanism för metastasering. Viktigt, vår ortotopiserat implanterade VHL-KO och VHL-WT modell leder till robusta lungmetastaser, rekapitulation kliniska ccRCC fall. Denna spontana metastaserande ccRCC modell kompenserar för bristen på en transgen ögonbevarande mus modell, särskilt i utvecklingen av nya anti-metastasering droger. Detta protokoll visar njurkapselimplantation av heterogena cellpopulationer av genetiskt modifierade RENCA-celler.
Kyckling CAM modeller har en lång historia inom forskning för angiogenes och tumörbiologi på grund av deras många fördelar, som sammanfattas i tabell 114,15,16,17,18. Kort är tidsfönstret för CAM tumör tillväxt kort, vilket gör att högst 11 dagar tills CAM förstörs vid kläckning av kyckling16. Trots den korta tillväxttiden, den rika näringstillförsel och immunodeficient tillstånd kyckling embryo möjliggör mycket effektiv tumör engraftment16,19,20,21. Slutligen är kostnaden för varje befruktat ägg ~ $ 1, jämfört med över $ 100 för en SCID mus. Tillsammans kan CAM-modellen fungera som en värdefull alternativ djurmodell för att etablera nya PDF-filer till en stor besparing i tid och kostnad jämfört med musen. I detta protokoll bedömde vi om modellen kunde sammanfatta biologin hos metastaserande ccRCC som observerats i musortotopmodellen.
| – Jag vet inte vad du ska göra. Musen | Cam | Observera | |
| Kostnad | >$100 vardera | ~$1 vardera | Lönsamhet från 50-75% |
| Behov av barriärhus | Ja | Nej | Ytterligare minskar kostnaderna och förenklar seriell övervakning av tumörer |
| Tumör direkt synlig | Nej | Ja | Figur 3A |
| Dags att först engraftment (RENCA) | 2 veckor | 2-4 dagar | ref 14, 15 |
| Tillväxtpunkt (RENCA) | 3-6 veckor | 10 dagar | ref 14, 15 |
| Metastasering (RENCA) observerad | Ja | Ja hos kycklingar | Bild 3D |
| Seriella passager | Ja | Ja | ref 16-18 |
| Passage till möss (RENCA) | Ja | Ja | Hu, J., et al. under översyn (2019) |
| Underhåll tumör heterogenitet | Ja | Ja | Hu, J., et al. under översyn (2019) |
Tabell 1: Fördelar och begränsningar för musen och CAM-modellerna. Denna tabell jämför de två modellerna för sina fördelar och begränsningar när det gäller obligatorisk tid, kostnad, arbete, samt biologi. CAM-modellen har fördelar med effektivitet, men den har också sina egna unika begränsningar på grund av de olika morfologi mellan fåglar och däggdjur. Därför är det viktigt att bekräfta att modellen kan behålla biologi xenografts.
Protocol
Representative Results
Discussion
För många patienter med epitel maligniteter, metastasering till vitala organ är den främsta orsaken till dödligheten. Därför är det viktigt att hitta den underliggande mekanismen och en ny väg för behandling för metastaserande sjukdom. Tyvärr finns det en brist på relevanta metastaserande ccRCC djurmodeller. Utmaningen till stor del beror på oförmåga att återskapa ccRCC hos möss trots generering av många transgena njurepithelial-riktade VHL knockout mus modeller9,<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av UCLA JCCC utsäde bidrag, UCLA 3R bidrag, UCLA CTSI, och UC TRDRP (LW). Vi tackar Crump Institutets prekliniska imaging facility, TPCL, och UCLA: s Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) för deras hjälp med experimentella metoder. Flow cytometri utfördes i UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) och Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility som stöds av National Institutes of Health Awards P30 CA016042 och 5P30 AI028697, och av JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine vid UCLA, UCLA Kansler’s Office, och UCLA Kansler Vice’s Office of Research. Statistik konsulttjänster och dataanalys tjänster tillhandahölls av UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, och Research Design (BERD) Program som stöds av NIH / National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. . Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. . Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
