Infection chronique, aigue et réactivée du VIH dans des modèles de souris immunodéficientes humanisés

Summary

On décrit ici trois approches expérimentales pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH chez les souris humanisées. Le premier permet l'étude des événements d'infection chronique, tandis que les deux derniers permettent l'étude des événements aigus après l'infection primaire ou la réactivation virale.

Abstract

Les souris^nulles humanisées de NOD/SCID/IL-2 de récepteur de chaîne de NOD/SCID/IL-2 récapitulent certaines caractéristiques de l'immunité humaine, qui peuvent être exploitées dans la recherche fondamentale et préclinique sur des maladies infectieuses. Décrit ici sont trois modèles de souris immunodéficientes humanisées pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH. La première est basée sur l'injection intrahépatique de cellules souches hématopoïétiques CD34^chez les souris nouveau-nées, ce qui permet la reconstitution de plusieurs cellules confinées dans le sang et les lymphoïdes, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH. Ce modèle permet de surveiller jusqu'à 36 semaines après l'infection et est donc appelé le modèle chronique. Les deuxième et troisième modèles sont appelés modèles aigus et de réactivation, dans lesquels les cellules mononucléaires périphériques de sang sont injectées par voie intrapéritone chez les souris adultes. Dans le modèle aigu, les cellules d'un donneur sain sont greffées par la voie intrapéritonéale, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH. Enfin, dans le modèle de réactivation, les cellules d'un donneur infecté par le VIH sous traitement antirétroviral sont greffées par voie intrapéritonéale. Dans ce cas, un environnement sans drogue chez la souris permet la réactivation du virus et une augmentation de la charge virale. Les protocoles fournis ici décrivent l'approche expérimentale conventionnelle pour les modèles humains et immunodéficients de souris de l'infection par le VIH.

Introduction

Le modèle humanisé de souris NOD/SCID/interleukin (IL)-2 récepteur (ci-après appelé huNS -chaîne^nulle)modèle de souris a été largement utilisé pour étudier la pathogénie des infections, l'auto-immunité, et le cancer, ainsi que pour les études précliniques des médicaments et des thérapies à base de cellules humaines^1,2. Ces souris sont basées sur un fond diabétique non-obèse (NOD), avec la mutation cid et la mutation ciblée au locus de chaîne de récepteur d'IL-2 (chaîne commune pour IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, et IL-21), qui induisent une altération grave dans le développement ....

Protocol

Dans le cadre de ce travail, tous les soins et procédures pour animaux ont été exécutés selon des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'École de médecine de l'Université du Maryland (numéros de protocole 1018017, 1018018 et 0318009).

1. L'engraftment humain de CD34^et de HSC des souris nouveau-nées

1. Utilisez toujours de l'équipement de protection personnelle jetable (EPI), y compris des gommages stériles, des gants, des chaussures dédiées, des couvre-chaussures, un masque, des lunettes, un bonnet de cheveux et de barbe et des blouses de laboratoire....

Results

Comme décrit ci-dessus, à 14 semaines après l'injection de HSC (modèle chronique) ou à 3 semaines d'injection post-PBMC (modèles aigus et de réactivation), les souris sont saignées pour le dépistage du niveau d'engraftment des cellules humaines par cytométrie de flux. Une stratégie de gating représentative pour l'évaluation de 1) CD45 humain^et la reconstitution des cellules et 2) le pourcentage de CD4 et de CD8^et les lymphocytes T est indiqué dans la figure 1.......

Discussion

D'importants progrès ont été réalisés dans le développement de souches de souris immunodéficientes pour l'humanisation, avec un certain nombre d'options différentes qui peuvent être utilisées selon l'intérêt de la recherche¹. Fourni ici est un protocole général pour l'humanisation des souris^nulles n.-chaîne NS et souches génétiquement similaires à employer dans trois modèles différents pour étudier l'infection par le VIH. Dans la première approche expérimentale, les souris nouveau-nées .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 ml Microtubes à centrifuger	Neptune	3735.S.X
1,5 ml Tubes à microcentrifuger	Neptune	3745.S.X
10 ml Pipettes sérologiques	stellaires scénariques	VL-4090-0010
15 ml Tubes coniques	Stellar scientific	T15-600
25 ml Pipettes	sérologiques stellaires scénariques	VL-4090-0025
5 ml Pipettes sérologiques	Stellar sceintific	VL-4090-0005
50 ml Tubes coniques	Stellar scientific	T50-600
Tampon de lyse ACK	Qualité biologique	118-156-101
Tampons de préparation à l’alcool	Fisher scientific	06-669-62	Clone
CD3 anti-humain stérile UCHT1	Biolegend	300439	APC clone
CD4 anti-humain conjugué OKT4	Biolegend	317420	AF488 clone
CD45 anti-humain conjugué 2D1	Biolegend	368522	BV421
clone CD8 anti-humain conjugué SK1	Biolegend	344710	PerCP-Cy5.5
enceinte Biosafaty conjuguée niveau 2			si possible connectée à un chimeny exauste lors de la manipulation d’Isoflurane
Bonnet	Fisher scientific	17-100-900	Capuchon à usage unique pour la protection de base
Cavicide	Metrex	13-1000	Désinfectant de surface
CD34+ cellules	Lonza	2C-101	Autant de flacons disponibles auprès d’un seul donneur
Centrifugeuse	Beckman	65-6KR
Pot transparent	Amazon	77977
Tampon de gaze	de cotonFisher scientific	22-415-468	Blouses
de laboratoire stériles jetables	Fisher scientific	19-472-422
Microtubes EDTA	Greiner bio-one	450480
Masque facial	Fisher scientific	17-100-897
FACS solution de lysing	BD	340202
FBS premium HI	Atlanta biologicals	S1115OH
Ficoll	GE health one	17-1440-02
Cytomètre			Nous avons utilisé FACS Aria II
Tubes de cytométrie en flux	Falcon	352054	5 ml de polystyrène et
fond rond HIV BaL			Préparé dans notre plateforme uQUANT
PBMC			Volontaires séropositifs et négatifs
Infrarouge coussin chauffant	Venet scientific	DCT-25	Coussin chauffant thérapeutique temporaire pour petits animaux
Isentress (Raltégravir)	Merck	NSC 0006-0227061	Médicament antirétroviral pour traiter le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-inhibiteur de l’intégrase
Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Irradiateur			Équipement appartenant à l’université de Maryland
Micro pipettes
Microcentrifugeuse	Eppendorf
Souris boucles d’oreille	National Band & Tag company	1005-1L1
Natelson tubes de prélèvement sanguin	Fisher scientific	02-668-10
NOG-EXL	Taconic	HSCFTL-13395-F
Souris NSG	Jackson	5557	Temps femelles enceintes pour la greffe CD34 et Juvéniles pour la greffe
PBMC NSG-SGM3	Jackson	13062
Paraformaldéhyde 16 %	Microscopie électronique sciences	15710
PBS 1X pH 7.4	Gibco	100-10-023
Boîtes de Pétri	Fisher scientific	08-757-28
Quantistudio qPCR	machine Thermo	QS3
Réservoirs de réactifs	Costar	4870
Média RPMI 1640 1X	Gibco	11875-093
Chaussure couvre	Fisher scientific	17-100-911
Gants stériles jetables	Microflex	SUF-524
SuperScript II Synthèse premier brin SuperMix	Invitrogen	10080-400 Synthèse de	l’ADNc
Seringues 28-G x 1/2	BD	329-461
Seringues 29-G x 1/2	BD	324-702
Truvada (Emtricitabine et Tenofovir	Gilead	NDC 61958-0701-1	Médicament antirétroviral pour traiter le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-inhibiteur de la transcriptase analogue du niféloside
Trypan blue	Sigma	T8154	Numération et viabilité des cellules
Vick Vaporub	Santé scolaire	43214	Pommade à base de menthol et
d’eucalyptus Biologie moléculaire de l’eau Qualité	biologique	351-029-131