ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法
Summary
この記事では、長時間経過共焦点顕微鏡用に脆弱なゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明する。この低コストの方法は、任意の反転顕微鏡でイメージングするための通常のガラス底顕微鏡用皿を使用して簡単に行うことができます。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。
Abstract
発達のダイナミクスは、特定の組織または細胞において蛍光を発現する生きているトランスジェニックゼブラフィッシュ胚の共焦点タイムラプス顕微鏡法に続くことができる。全胚のイメージングの難しさは、ゼブラフィッシュ胚が実質的に長くなるということです。0.3~1%低溶融アガロースに定期的に取り付けられると、アガロースは成長制限を課し、軟胚体の歪みにつながります。しかし、共焦点タイムラプス顕微鏡を行うには、胚を固定化する必要があります。この記事では、無制限の成長を可能にしながら胚の運動性を制限するゼブラフィッシュ胚の層状取り付け方法について説明します。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。この方法のユーザビリティを実証するために、全胚血管、神経および筋肉の発達を55時間連続してトランスジェニック魚に画像化した。この取り付け方法は、金型や特殊装置の要件なしに、反転顕微鏡を使用してゼブラフィッシュ胚全体を簡単かつ低コストでイメージングするために使用できます。
Introduction
ゼブラフィッシュは長い間発達生物学のモデル生物であり、顕微鏡検査は胚発生を可視化する主要な方法である。発達研究のためにゼブラフィッシュ胚を使用する利点は、小さなサイズ、光学的明瞭さ、急速な発達、および成虫魚の高い胎児性を含む。特定の組織または細胞で蛍光を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインの生成は、より大きな脊椎動物では不可能な方法で組織の発達を直接可視化することを可能にした。タイムラプス顕微鏡と組み合わせることで、組織現像の詳細とダイナミクスを容易に研究することができる。
ゼブラフィッシュのイメージングの難しさは、胚が実質的に長くなるということです。胚は、寿命の最初の3日以内にその長さを4回延長します。また、初期胚の体は柔らかく、成長が制限されると歪みやすくなります。しかし、共焦点顕微鏡を行うには、胚を固定化する必要があります。胚を共焦点タイムラプスイメージングの固定位置に保つために、定期的に麻酔を行い、0.3~1%の低溶融アガロースに取り付けます。これは、胚の動きを制限しながら、一定期間のイメージング中にいくつかの成長を可能にするという利点を有する。胚の一部はこのように効率的に画像化することができる。しかし、この方法を長期間胚全体のイメージングに用いる場合、アガロースによる成長制限により歪みが見られる。したがって、他の取り付け方法が必要です。カウフマンたちは、無濃度のアガロースまたはメチルセルロース2を含むフッ素化エチレンプロピレン(FEP)チューブに胚を取り付けることにより、選択的プレーン照明顕微鏡(SPIM)などの光シート顕微鏡用ゼブラフィッシュ胚の代替実装について説明した。この技術は、時間の経過とともに胚発生の優れた可視化を生成します。Schmid et al. は、1 回のイメージング セッションで複数の胚の可視化を提供する光シート顕微鏡3用FEBチューブ中のアガロース内の最大6個の胚の取り付けについて説明する。金型は、より多くの数の胚4を効率的に取り付けるために胚アレイを作成するために使用されてきました。Masselkinkららは、ゼブラフィッシュ胚を異なる段階で配置できるシリコン鋳造物を作るために使用できる3Dプリントプラスチック金型を構築しており、共焦点イメージング5を含むイメージングのための一定の位置への取り付けを可能にする。3Dプリンティングはまた、96ウェルフォーマット6でゼブラフィッシュ胚の一貫した位置のための金型を作るために使用されています。一部の金型は特定のステージに合わせてカスタマイズされており、長期間無制限に成長できない場合がありますが、他の金型はより柔軟です。最近、Weijtsらゼブラフィッシュ胚の生イメージングのための4ウェル皿のデザインと製作を発表しました7.この料理では、麻酔をかけた魚の胚の尾と幹をカバーガラスのすぐ上に取り付けた透明なシリコーン屋根の下に手動で配置し、ポケットを形成します。胚は、0.4%アガロースを添加することによって、この位置に固定される。この取り付けにより、胚の約2mmの後部(幹および尾部)のイメージングが可能であり、ウェルごとに最大12個の胚を取り付けることができるように、この方法は複数のサンプルのイメージングを可能にする。同様に、ヒルシンガーとスティーブントンは最近、魚の頭部をアガロースに取り付け、尾部を自由に成長させる方法を提示し、この方法はまた、胚8の幹および尾部領域のイメージングを効率的に容易にする。
この記事では、無制限の成長を可能にしながら胚の動きを制限するゼブラフィッシュ胚の層状取り付け方法について説明します。この取り付け方法の利点は、任意の反転顕微鏡を用いてイメージングするための様々な段階の胚を取り付ける低コスト、迅速かつ容易な方法である。取り付けは胚の発達の間に全身(頭部、幹および尾)の長期のイメージ投射を可能にする。この方法の使いやすさを示すために、全胚血管、神経および筋肉の発達をトランスジェニック魚に画像化した。セッションあたり2つの胚は、3Dの2つの波長で、組織発達の映画をレンダリングするために55時間連続してタイムラプス顕微鏡によって画像化された。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡検査の取り付け方法について説明する。取り付け方法の最も重要なステップは、無制限のゼブラフィッシュ胚の成長を可能にするアガロースの最適な濃度を特定すると同時に、共焦点イメージングのために胚を完全に固定された位置に保つことです。アガロースの最適濃度は非常に狭いため、この値は、溶液の調製中にア?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
トランスジェニックな魚の贈り物に対してアルバート・パンとアルント・ジークマンに感謝します。国立遺伝学研究所の川上浩一氏に感謝します。 また、ファティマ・マーチャントとキャスリーン・ガジェフスキの共焦点顕微鏡検査への支援、写真のトレーシー・テリオー
この研究は、国立衛生研究所環境衛生研究所(助成金番号P30ES023512および契約番号HHSN273201500010C)からの助成金によって支援されました。SUは、ケック計算癌生物学プログラム(湾岸コンソーシアムCPRIT助成金RP140113)とヒュー・ロイとリリー・エンダウメント基金のフェローシップによって支援されました。J-Å Gはロバート・A・ウェルチ財団(E-0004)の支援を受けています。
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
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