Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Summary

Her præsenterer vi en robust protokol for at kvantificere 40 forbindelser involveret i Central Carbon og energimetabolisme i celle-fri proteinsyntese reaktioner. Den celle frie syntese blanding er derivatized med anilin for effektiv adskillelse ved hjælp af omvendt fase væskekromatografi og derefter kvantificeret ved massespektrometri ved hjælp af isotopisk mærkede interne standarder.

Abstract

Celle-fri Proteinsyntese (CFP’ER) er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi til in vitro-produktion af proteiner. Men hvis CFP’ER kommer til at bevæge sig ud over laboratoriet og blive en udbredt og standard lige i tiden fremstillingsteknologi, skal vi forstå de præstationsgrænser for disse systemer. Mod dette spørgsmål, vi udviklet en robust protokol til kvantificere 40 forbindelser involveret i glycolyse, pentose fosfat pathway, tricarboxylsyre cyklus, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS reaktioner. Metoden bruger interne standarder Tagged med ¹³c-Anilin, mens forbindelser i prøven er derivatized med ¹²c-anilin. De interne standarder og prøven blev blandet og analyseret ved omvendt fase væskekromatografi-massespektrometri (LC/MS). Co-eluering af forbindelser eliminerede ionsuppression, hvilket gjorde det muligt nøjagtigt at kvantificere metabolitten koncentrationer over 2-3 størrelsesordener, hvor den gennemsnitlige korrelationskoefficient var 0,988. Fem af de 40 forbindelser blev ukodet med Anilin, men de blev stadig påvist i CFPS-prøven og kvantificerede med en standardkurve metode. Kromatografi kørslen tager ca. 10 min. for at fuldføre. Tilsammen udviklede vi en hurtig og robust metode til at adskille og præcist kvantificere 40-forbindelser, der er involveret i CFP’ER, i en enkelt LC/MS-løbetur. Metoden er en omfattende og præcis tilgang til at karakterisere cellefri metabolisme, så vi i sidste ende kan forstå og forbedre udbyttet, produktiviteten og energieffektiviteten af celle frie systemer.

Introduction

Celle-fri Proteinsyntese (CFP’ER) er en lovende platform for fremstilling af proteiner og kemikalier, en applikation, der traditionelt har været forbeholdt levende celler. Celle frie systemer er afledt af rå celleekstrakter og eliminere komplikationer forbundet med cellevækst¹. Derudover giver CFP’ER mulighed for direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden indblanding fra en cellevæg. Der har imidlertid manglet en grundlæggende forståelse af præstations grænserne for celle frie processer. High-gennemløb metoder til metabolisering kvantificering er værdifulde for karakterisering af stofskiftet og er afgørende for opførelsen af metaboliske beregningsmæssige modeller^2,3,4. Fælles metoder, der anvendes til bestemmelse af metabolitten koncentrationer omfatter nuklear magnetisk resonans (NMR), Fourier transformation-infrarød spektroskopi (ft-IR), enzym-baserede assays, og massespektrometri (MS)^{5,6,7 ,8}. Men, disse metoder er ofte begrænset af deres manglende evne til effektivt at måle flere forbindelser på én gang og ofte kræver en prøvestørrelse større end typiske celle-fri reaktioner. For eksempel kan enzym baserede assays ofte kun bruges til at kvantificere en enkelt forbindelse i en løbetur og er begrænset, når Prøvestørrelsen er lille, såsom i celle frie proteinsyntese reaktioner (typisk på en 10-15 μL skala). I mellemtiden kræver NMR en høj forekomst af metabolitter til påvisning og kvantificering⁵.  Mod disse mangler, kromatografi metoder i tandem med massespektrometri (LC/MS) giver flere fordele, herunder høj følsomhed og evnen til at måle flere arter samtidigt⁹; den analytiske kompleksitet stiger imidlertid betydeligt med antallet og mangfoldigheden af de arter, der måles. Det er derfor vigtigt at udvikle metoder, der fuldt ud realisere de høje gennemløb potentiale LC/MS-systemer. Forbindelser i en prøve adskilles ved hjælp af væskekromatografi og identificeres gennem massespektrometri. Signalet af forbindelsen afhænger af dets koncentration og ioniserings effektivitet, hvor ioniseringen kan variere mellem forbindelser og kan også afhænge af prøve matrixen.

Opnåelse af samme ioniserings effektivitet mellem prøven og standarderne er en udfordring, når LC/MS bruges til at kvantificere analytter. Yderligere, kvantificering bliver mere udfordrende med metabolitten mangfoldighed på grund af signal opdeling og heterogenitet i proton affinitet og polaritet¹⁰. Endelig kan Co-eluting matrix af prøven også påvirke ioniserings effektiviteten af forbindelserne. For at løse disse problemer, metabolitter kan være kemisk derivatized, øge separation opløsning og følsomhed ved LC/MS-systemer, mens samtidig faldende signal opdeling i nogle tilfælde^10,11. Kemisk derivatisering virker ved at tagge specifikke funktionelle grupper af metabolitter til at justere deres fysiske egenskaber som ladning eller hydrofobicitet for at øge ioniserings effektivitet¹¹. Forskellige mærknings agenter kan anvendes til at målrette mod forskellige funktionelle grupper (f. eks. aminer, hydroxyls, phosphater, carboxylsyrer osv.). Aniline, en sådan forædling agent, mål flere funktionelle grupper på én gang, og tilføjer en hydrofobe komponent i hydrofile molekyler, og dermed øge deres separation opløsning og signal¹². For at imødegå den Co-eluting matrix ion suppression effekt, Yang og kollegaer udviklet en teknik baseret på gruppe specifik intern standard teknologi (gsist) mærkning, hvor standarder er mærket med ¹³C anilin isotoper og blandes med prøven ^12,13. Metabolitten og den tilsvarende interne standard har samme ioniserings effektivitet, da de er co-elute, og deres intensitets forhold kan anvendes til at kvantificere koncentrationen i den eksperimentelle prøve.

I denne undersøgelse udviklede vi en protokol til påvisning og kvantificering af 40-forbindelser, der er involveret i glykolyse, pentose-fosfat vejen, tricarboxylsyrecyklussen, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS-reaktioner. Metoden er baseret på GSIST tilgang, hvor vi brugte ¹²c-aniline og ¹³c-anilin til at mærke, opdage og kvantificere metabolitter ved hjælp af omvendt fase LC/MS. Det lineære område af alle forbindelser strakte 2-3 størrelsesordener med en gennemsnitlig korrelationskoefficient på 0,988. Således, metoden er en robust og præcis tilgang til afhøre celle-fri metabolisme, og muligvis helcelle ekstrakter.

Protocol

1. klargøring af reagenser til anilin mærkning Forbered en 6 M anilin opløsning ved pH 4,5. Arbejder i en hætte, kombinere 550 μL anilin med 337,5 μL LCMS kvalitet vand og 112,5 μL af 12 M saltsyre (HCl) i et centrifugeglas. Vortex brønd og opbevares ved 4 °C.Bemærk: anilin kan opbevares ved 4 °C i 2 måneder.Forsigtig: anilin er meget giftigt og bør behandles med i en røg hætte. Saltsyre er meget ætsende Forbered en 6 M 13C anilin opløsning ved pH 4,5. Kombiner 250 …

Representative Results

Som et proof-of-koncept brugte vi protokollen til at kvantificere metabolitter i et E. coli -baseret CFPS-system, der udtrykker grønt fluorescerende protein (gfp).  CFPS-reaktionen (14 μL) blev standset og deproteiniseret med ethanol. CFPS-prøven blev derefter mærket med 12c-Anilin, mens standarderne blev mærket med 13c-anilin. Den mærkede prøve og standarderne blev derefter kombineret og injiceret i LC/MS (figur 1). Protokollen afslørede og kvantifice…

Discussion

Celle frie systemer har ingen cellevæg, og der er således direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden behov for kompleks prøveforberedelse. Men meget lidt arbejde er blevet gjort for at udvikle grundige og robuste protokoller til kvantitativt afhøre celle-fri reaktionssystemer. I denne undersøgelse udviklede vi en hurtig, robust metode til at kvantificere metabolitter i celle frie reaktionsblandinger og potentielt i helcelle ekstrakter. Individuel kvantificering af metabolitter i komplekse blan…

Materials

12C Aniline	Sigma-Aldrich	242284	Aniline 12C
13C labeled aniline	Sigma-Aldrich	485797	Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Acetic Acid	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitrile, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetyl-coenzyme A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column	Waters	186002353	Column
Adenosine diphosphate	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Adenosine monophosphate	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Adenosine triphosphate	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alpha-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Citrate	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Cytidine diphosphate	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Cytidine monophosphate	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Cytidine triphosphate	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Erythrose 4-phosphate	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Ethanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge	FisherScientific		Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Fructose 1,6-bisphosphate	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Fructose 6-phosphate	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
Fumarate	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Gluconate 6-phosphate	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glucose 6-phosphate	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
Glycerol 3-phosphate	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Guanosine diphosphate	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Guanosine monophosphate	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Guanosine triphosphate	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Isocitrate	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Lactate	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
Malate	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Phosphoenolpyruvate	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribose 5-phosphate	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulose 5-phosphate	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate	CarboSynth	MS07457	S7P
Succinate	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributylamine	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Triethylamine	FisherScientific	O4884	TEA
ultrapure water	FisherScientific	10977-015	water
Uridine diphosphate	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Uridine monophosphate	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Uridine triphosphate	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Heavy Duty Vortex	VWR		Vortex
Water, LCMS	JT BAKER	9831-03	WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager	Waters		LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN	Waters		LCMS
Waters Acquity Qda detector	Waters		LCMS
Waters Empower 3	Waters		Software
Waters LCMS Total Recovery Vial	Waters	186000384c	LCMS Vial