उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण चयापचय का निरपेक्ष क्वांटिफिकेशन
Summary
यहाँ, हम सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में केंद्रीय कार्बन और ऊर्जा चयापचय में शामिल 40 यौगिकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सेल मुक्त संश्लेषण मिश्रण उलट चरण तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर प्रभावी जुदाई के लिए aniline के साथ derivatized है और फिर समस्थानिक आंतरिक मानकों का उपयोग कर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा परिमाणित.
Abstract
सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपी) प्रोटीन के इन विट्रो उत्पादन के लिए सिस्टम और सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक उभरती हुई तकनीक है। हालांकि, अगर CFPS प्रयोगशाला से परे ले जाने के लिए और सिर्फ समय विनिर्माण प्रौद्योगिकी में एक व्यापक और मानक बन जा रहा है, हम इन प्रणालियों के प्रदर्शन की सीमा को समझना चाहिए. इस प्रश्न की ओर, हमने ग्लाइकोलिसिस में शामिल 40 यौगिकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल विकसित किया है, पेंटोज फॉस्फेट मार्ग, ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड चक्र, ऊर्जा चयापचय और सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं में सहकारक पुनर्जनन। विधि 13सी-एनलाइन के साथ टैग आंतरिक मानकों का उपयोग करता है, जबकि नमूने में यौगिकों के साथ derivatized हैं 12सी-एनलाइन. आंतरिक मानकों और नमूना मिश्रित और उलट चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / यौगिकों के सह-उत्सर्जन आयन दमन का सफाया, जहां औसत सहसंबंध गुणांक 0.988 था परिमाण के 2-3 आदेश पर चयापचय सांद्रता का सही परिमाण की अनुमति. चालीस यौगिकों में से पांच aniline के साथ untagged थे, तथापि, वे अभी भी CFPS नमूना में पाया गया और एक मानक वक्र विधि के साथ परिमाणित. क्रोमैटोग्राफी रन को पूरा करने के लिए लगभग 10 मिनट लगते हैं। एक साथ लिया, हम एक एकल LC/MS रन में CFPS में शामिल 40 यौगिकों को अलग और सही मात्रा में करने के लिए एक तेजी से, मजबूत विधि विकसित की है। विधि सेल मुक्त चयापचय की विशेषता के लिए एक व्यापक और सटीक दृष्टिकोण है, ताकि अंततः, हम समझते हैं और उपज, उत्पादकता और सेल मुक्त प्रणाली की ऊर्जा दक्षता में सुधार कर सकते हैं.
Introduction
सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (CFPS) प्रोटीन और रसायनों के निर्माण के लिए एक आशाजनक मंच है, एक आवेदन है कि परंपरागत रूप से जीवित कोशिकाओं के लिए आरक्षित किया गया है. सेल-मुक्त प्रणालियां कच्चे सेल निष्कर्षों से प्राप्त होती हैं और सेल वृद्धि1से जुड़ी जटिलताओं को समाप्त करती हैं। इसके अलावा, CFPS एक सेल दीवार के हस्तक्षेप के बिना चयापचयों और जैव संश्लेषण मशीनरी के लिए सीधी पहुँच के लिए अनुमति देता है. हालांकि, सेल मुक्त प्रक्रियाओं के प्रदर्शन की सीमा की एक मौलिक समझ की कमी रही है. मेटाबोलाइट परिमाणीकरण के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियां चयापचय की विशेषता के लिए मूल्यवान हैं और चयापचय अभिकलन मॉडल2,3,4के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं। मेटाबोलाइट सांद्रता निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य तरीकों में परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), फूरिये ट्रांसफॉर्म-इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटी-आईआर), एंजाइम-आधारित परख, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)5,6,7 शामिल हैं ,8. हालांकि, इन विधियों अक्सर कुशलतापूर्वक एक बार में कई यौगिकों को मापने के लिए अपनी असमर्थता द्वारा सीमित कर रहे हैं और अक्सर एक नमूना आकार ठेठ सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं से अधिक की आवश्यकता होती है. उदाहरण के लिए, एंजाइम-आधारित assays अक्सर केवल एक रन में एक एकल यौगिक मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और सीमित कर रहे हैं जब नमूना आकार छोटा है, जैसे सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में (आमतौर पर एक 10-15 डिग्री सेल्सियस पैमाने पर चला). इस बीच, NMR का पता लगाने और परिमाणीकरण5के लिए चयापचयों की एक उच्च बहुतायत की आवश्यकता है. इन कमियों की ओर, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस) के साथ मिलकर क्रोमैटोग्राफी विधियों में कई लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें उच्च संवेदनशीलता और एक साथ कई प्रजातियों को मापने की क्षमता9; हालांकि, संख्या और प्रजातियों की विविधता मापा जा रहा है के साथ विश्लेषणात्मक जटिलता काफी बढ़ जाती है। इसलिए, ऐसे तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो एलसी/एमएस प्रणालियों की उच्च-थ्रूपुट क्षमता को पूरी तरह से महसूस करते हैं। एक नमूने में यौगिकों तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कर रहे हैं और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पहचान की. यौगिक के संकेत अपनी एकाग्रता और आयनन दक्षता पर निर्भर करता है, जहां आयनन यौगिकों के बीच भिन्न हो सकते हैं और भी नमूना मैट्रिक्स पर निर्भर हो सकता है.
नमूने और मानकों के बीच एक ही आयनन दक्षता प्राप्त करना एक चुनौती है जब LC/MS का उपयोग करने के लिए analytes मात्रा. इसके अतिरिक्त, प्रोटॉन आत्मीयता और ध्रुवता10में संकेत विभाजन और विषमता के कारण मेटाबोलाइट विविधता के साथ परिमाणीकरण अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है। अंत में, नमूने के सह-इल्ाउटिंग मैट्रिक्स भी यौगिकों के आयनन क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, चयापचयों को रासायनिक रूप से derivatized किया जा सकता है, LC/MS सिस्टम द्वारा पृथक्करण संकल्प और संवेदनशीलता में वृद्धि, जबकि साथ ही कुछ मामलों में संकेत विभाजन को कम करते हुए10,11. रासायनिक व्युत्पत्तीकरण आयनन दक्षता 11 में वृद्धि करने के लिए आवेश या हाइड्रोफोबिकिटी जैसे भौतिक गुणों को समायोजित करने के लिए चयापचयों के विशिष्ट कार्यात्मक समूहों को टैग करके काम करताहै। विभिन्न टैगिंग एजेंटों विभिन्न कार्यात्मक समूहों (उदा., amines, hydroxyls, फॉस्फेट, carboxylic एसिड, आदि) को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एनिलिन, एक ऐसा ही व् युद्धिकरण एजेंट, एक ही बार में अनेक कार्यात्मक समूहों को लक्षित करता है, और हाइड्रोफिलिक अणुओं में हाइड्रोफोबिक घटक जोड़ता है, जिससे उनके पृथक्करण संकल्प और संकेत12में वृद्धि होती है। सह-eluting मैट्रिक्स आयन दमन प्रभाव को संबोधित करने के लिए, यांग और सहकर्मियों समूह विशिष्ट आंतरिक मानक प्रौद्योगिकी (GSIST) लेबलिंग जहां मानकों 13सी anisopes के साथ टैग और नमूने के साथ मिश्रित कर रहे हैं पर आधारित एक तकनीक विकसित 12,13. चयापचय और इसी आंतरिक मानक एक ही आयनन दक्षता के बाद से वे सह-ल्यूट है, और उनकी तीव्रता अनुपात प्रयोगात्मक नमूना में एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल का पता लगाने और ग्लाइकोलिसिस में शामिल 40 यौगिकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित की है, पेंटोज फॉस्फेट मार्ग, tricarboxylic एसिड चक्र, ऊर्जा चयापचय और CFPS प्रतिक्रियाओं में cofactor पुनर्जनन. विधि GSIST दृष्टिकोण पर आधारित है, जहां हम 12सी-एनलाइन और 13सी-एनिलाइन का उपयोग टैग करने के लिए, का पता लगाने, और उलट चरण LC /MS का उपयोग चयापचयों मात्रा निर्धारित. सभी यौगिकों की रैखिक श्रेणी 0ण्988 के औसत सहसंबंध गुणांक के साथ परिमाण के 2-3 क्रम फैला हुआ है। इस प्रकार, विधि सेल मुक्त चयापचय पूछताछ करने के लिए एक मजबूत और सटीक दृष्टिकोण है, और संभवतः पूरे सेल अर्क.
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल मुक्त सिस्टम कोई सेल दीवार है, इस प्रकार जटिल नमूना तैयार करने के लिए आवश्यकता के बिना चयापचयों और जैव संश्लेषी मशीनरी के लिए सीधी पहुँच है. तथापि, सेल-मुक्त प्रतिक्रिया प्रणालियों पर मात्रात्मक र?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (https://www.cancer.gov/ ) से पुरस्कार संख्या 1U54CA210184-01 के माध्यम से कैंसर चयापचय के भौतिकी पर केंद्र द्वारा वर्णित काम का समर्थन किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
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