Mønster for geometrien af humane embryonale stamcelle kolonier på kompatible substrater til kontrol af Vævsniveau mekanik
Summary
Ekstracellulære matrix ligander kan mønstrede på polyacrylamid silicagelrogeler for at muliggøre kulturen af humane embryonale stamceller i indelukkede kolonier på kompatible substrater. Denne metode kan kombineres med Traction Force mikroskopi og biokemiske analyser for at undersøge samspillet mellem vævs geometri, celle genererede kræfter og skæbne specifikation.
Abstract
Humane embryonale stamceller viser en unik evne til at reagere på morfogener in vitro ved selvorganiserende mønstre af celle skæbne specifikation, der svarer til primær kimlag dannelse under embryogenese. Således, disse celler repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at undersøge de mekanismer, der kører tidligt menneskelig udvikling. Vi har udviklet en metode til dyrkning af humane embryonale stamceller i lukkede kolonier på kompatible substrater, der giver kontrol over både Koloniernes geometri og deres mekaniske miljø for at rekapitulere de fysiske parametre, der ligger til grund for embryogenesis. Det vigtigste træk ved denne metode er evnen til at generere polyacrylamid silicagelrogeler med definerede mønstre af ekstracellulære matrix ligand på overfladen for at fremme celle fastgørelse. Dette opnås ved fabrikning stencils med de ønskede geometriske mønstre, ved hjælp af disse stencils til at skabe mønstre af ekstracellulære matrix ligand på glas dæksedler, og overføre disse mønstre til polyacrylamid silicagelrogeler under polymerisering. Denne metode er også kompatibel med Traction Force mikroskopi, så brugeren kan måle og kort fordelingen af celle-genererede kræfter inden for de lukkede kolonier. I kombination med standard biokemiske assays, kan disse målinger bruges til at undersøge den rolle mekaniske signaler spiller i skæbne specifikation og morfogenese under tidlig menneskelig udvikling.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) holder stort løfte om anvendelse i regenerativ medicin og vævsteknik applikationer. Den pluripotente karakter af disse celler giver dem mulighed for at differentiere sig til enhver voksen celletype. Mens der er gjort store fremskridt med hensyn til at dirigere hESCs skæbne til bestemte celletyper, har det været meget vanskeligt at generere hele væv eller organer de Novo1,2,3,4, 5. Dette skyldes for en stor del, at en begrænset forståelse af de mekanismer, der drev dannelsen af disse væv under menneskelig udvikling. For at udfylde dette hul i viden er der i de senere år blevet udviklet en række metoder til at modellere det tidlige embryon og de efterfølgende udviklingsstadier med embryonale stamceller6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kort efter afledningen af de første hESC linjer14, blev det påvist, at embryooide organer dannet af hESCs var i stand til spontant at producere celler af de tre primære kimlag6. Men på grund af den iboende mangel på kontrol over størrelsen og morfologi af embryooid organer, organiseringen af kimlag varierede betydeligt og undlod at matche organiseringen af det tidlige embryo. For nylig, Warmflash et al. udviklet en metode til at begrænse kolonier af hESCs på glas substrater via micropatterning, der giver kontrol og konsistens over størrelsen og geometri af kolonierne8. I nærværelse af BMP4, en vigtig morphogen i tidlig udvikling, disse lukkede kolonier var i stand til selv at organisere reproducerbare mønstre specifikation til skæbner, der repræsenterer de primære kimlag. Selv om dette gav en nyttig model for at studere de mekanismer, som primære kimlag er etableret, de mønstre af skæbne specifikation ikke præcist matche organisationen og morfogenesis observeret under embryo Genesis15. En mere trofast rekapitaliering af tidlig fosterudvikling blev opnået ved at indlejre hESCs i en tredimensionel ekstracellulær matrix (ECM) af matrigels11, hvilket giver de stærkeste beviser til dato for evnen af hESCs til selv-organisere og model de tidlige stadier af embryogenese ex vivo. Men denne metode giver inkonsekvente resultater og er derfor uforenelig med en række analyser, der kunne bruges til at afsløre de underliggende mekanismer for selvorganisering og skæbne specifikation.
I betragtning af disse eksisterende metoder og deres respektive begrænsninger søgte vi at udvikle en metode til reproducerbart dyrkning af hESC-kolonier af definerede geometrier under forhold, der modellere det ekstracellulære miljø i det tidlige embryon. For at opnå dette, brugte vi polyacrylamid silicagelrogeler af tunbar elasticitet til at kontrollere de mekaniske egenskaber af substratet. Ved hjælp af atomkraften mikroskopi på gastrulation-Stage kylling embryoner, vi fandt, at elasticiteten i epiblast varierede fra hundredvis af Pascal til et par kilopascals. Derfor fokuserede vi på at generere polyacrylamid silicagelrogeler med elasticitet i dette interval for at fungere som substrat for hesc-kolonier. Vi ændrede vores tidligere metoder til dyrkning af hESCs på polyacrylamid silicagelrogeler7,9 for at give solid kontrol over koloniens geometri. Vi opnåede dette ved første mønstring ECM ligands, nemlig matrigel, på glas dæksedler gennem mikrofremstillede stencils, som tidligere rapporteret16. Derefter designede vi en ny teknik til at overføre det mønstrede ligand til overfladen af polyacrylamid silicagelrogeler under Polymeriseringen. Den metode, vi beskriver her, involverer brug af fotolitografi til at fabrikere en silicium wafer med de ønskede geometriske mønstre, skabe stempler af disse geometriske egenskaber med Polydimethylsiloxan (PDMS), og ved hjælp af disse stempler til at generere de stencils, der i sidste ende tillader mønstret af ligand på overfladen af glas dæksedler og overførsel til polyacrylamid.
Ud over at rekapitulere det mekaniske miljø i det tidlige embryon gør det at begrænse hESC-kolonier på polyacrylamid det muligt at målecelle genererede kræfter med trækkraft mikroskopi (TFM), som rapporteret i vores tidligere metode9. Kort sagt kan fluorescerende perler indlejres i polyacrylamid og anvendes som fiducial markører. Celle genererede kræfter beregnes ved at afbilde forskydningen af disse perler efter såning af hESCs på det mønstrede substrat. Desuden kan de resulterende trækkraft kort kombineres med traditionelle assays, såsom immun farvning, at undersøge, hvordan fordelingen af celle-genererede kræfter i lukkede hESC kolonier kan regulere eller moduere downstream signalering. Vi forventer, at disse metoder vil afsløre, at mekaniske kræfter spiller en afgørende rolle i mønstret af celle skæbne specifikation under tidlig fosterudvikling, der i øjeblikket overset.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at forenkle en lang og detaljeret protokol består denne metode af tre kritiske stadier: 1) generering af ECM ligand på glas dæksedler, 2) overførsel af mønstrene til polyacrylamid silicagelrogeler under Polymeriseringen af gelen og 3) såning af hESCs på mønstrede hydrogel. Der er kritiske skridt, der skal tages i betragtning i hver af disse tre etaper. For at skabe high-fidelity mønstre på glasset dæksedler, skal stencilen være solidt presset på dækglas for at forhindre lækage af ligand opløsning og a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende finansieringen fra CIRM Grant RB5-07409. J.M.M. vil gerne takke FuiBoon Kai, Dhruv thakar og Roger Oria for forskellige diskussioner, der guidede generering og fejlfinding af denne metode. J.M.M. også takke UCSF Discovery Fellowship for den løbende støtte af hans arbejde.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
