Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização
Summary
Apresentamos um método de citometria de fluxo para identificar simultaneamente diferentes tipos de células recuperadas do cérebro do rato ou da medula espinhal. Este método poderia ser explorado para isolar ou caracterizar populações de células puras em doenças neurodegenerativas ou para quantificar a extensão das células que visam a administração in vivo de vetores virais ou nanopartículas.
Abstract
Os recentes avanços nas ciências viral de vetores e nanomateriais abriram caminho para novas abordagens de ponta para investigar ou manipular o sistema nervoso central (SNC). No entanto, uma maior otimização dessas tecnologias se beneficiaria de métodos que permitam a determinação rápida e simplificada da extensão do SNC e da segmentação específica das células sobre a administração de vetores virais ou nanopartículas no corpo. Aqui, apresentamos um protocolo que aproveita as capacidades de alta produtividade e multiplexing da citometria de fluxo para permitir uma quantificação direta de diferentes subtipos celulares isolados do cérebro do rato ou da medula espinhal, ou seja, microglia / macrófagos, linfócitos, astrócitos, oligodendrócitos, neurônios e células endotélias. Aplicamos essa abordagem para destacar diferenças críticas entre dois métodos de homogeneização de tecidos em termos de rendimento celular, viabilidade e composição. Isso poderia instruir o usuário a escolher o melhor método, dependendo do tipo de célula (s) de interesse e da aplicação específica. Este método não é adequado para análise da distribuição anatômica, uma vez que o tecido é homogeneizado para gerar uma suspensão unicelular. No entanto, ele permite trabalhar com células viáveis e pode ser combinado com a classificação celular, abrindo o caminho para várias aplicações que poderiam expandir o repertório de ferramentas nas mãos do neurocientista, que vão desde o estabelecimento de culturas primárias derivadas de populações de células puras, a análises de expressão gênica e ensaios bioquímicos ou funcionais sobre subtipos celulares bem definidos no contexto de doenças neurodegenerativas, sobre o tratamento farmacológico ou terapia gênica.
Introduction
Tecnologias de entrega de genes e medicamentos (como vetores virais e nanopartículas) tornaram-se uma ferramenta poderosa que pode ser aplicada para obter melhores insights sobre vias moleculares específicas alteradas em doenças neurodegenerativas e para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras1,2,3. A otimização dessas ferramentas depende da quantificação de: (1) a extensão da penetração no SNC sobre diferentes rotas de administração e (2) direcionamento de populações celulares específicas. Análises histológicas são geralmente aplicadas para visualizar genes de repórter fluorescente ou nanopartículas marcadas fluorescentemente em diferentes áreas do SNC e em diferentes tipos de células, identificadas pela imunomancha para marcadores celulares específicos4,5. Mesmo que essa abordagem forneça informações valiosas sobre a biodistribuição das ferramentas administradas de gene ou entrega de drogas, a técnica pode ser demorada e intensa em termos de trabalho, pois requer: (1) fixação de tecidos, criopreservação ou parafina emindamento e corte; (2) coloração para marcadores celulares específicos, por vezes, exigindo recuperação de antígenos; (3) aquisição por microscopia de fluorescência, que geralmente permite a análise de um número limitado de marcadores diferentes dentro do mesmo experimento; (4) processamento de imagem para permitir a quantificação adequada do sinal de interesse.
A citometria do fluxo tornou-se uma técnica amplamente utilizada que aproveita marcadores fluorescentes muito específicos para permitir não apenas uma rápida avaliação quantitativa de diferentes fenótipos celulares em suspensões celulares, com base na expressão de antígenos superficiais ou intracelulares, mas também medições funcionais (por exemplo, taxa de apoptose, proliferação, análise do ciclo celular, etc.). O isolamento físico das células através da triagem de células ativadas fluorescentes também é possível, permitindo novas aplicações a jusante (por exemplo, cultura celular, RNAseq, análises bioquímicas etc.) 6,7,8.
A homogeneização do tecido é um passo crítico necessário para obter uma suspensão de célula única para permitir avaliações citométricas confiáveis e reprodutíveis de fluxo a jusante. Diferentes métodos têm sido descritos para homogeneização cérebro-tecido adulto, principalmente com o objetivo de isolar as células microglia9,10,11; eles podem ser classificados globalmente em duas categorias principais: (1) dissociação mecânica, que utiliza força de moagem ou corte através de um homogeneizador Dounce (DH) para rasgar as células de seus nichos e formar uma suspensão celular relativamente homogeneizada única, e (2) digestão enzimática, que depende da incubação de pedaços de tecido picado em 37 °C na presença de enzimas proteolíticas, como trippsina ou papaina, favorecendo a degradação da matriz extracelular para criar uma suspensão de células homogeneizadas12.
Independentemente de qual método é utilizado, uma etapa de purificação é recomendada após a homogeneização do tecido para remover a mielina através da centrífuga em um gradiente de densidade ou por seleção magnética9,12,antes de passar para as aplicações a jusante.
Aqui, descrevemos um método de processamento de tecidos baseado na digestão da papana (DP), seguido de purificação em um gradiente de densidade, otimizado para obter suspensões de células heterogêneas viáveis do cérebro do rato ou da medula espinhal de forma sensível ao tempo e adequada para citometria de fluxo. Além disso, descrevemos um painel de citometria de fluxo de 9 cores e a estratégia de gating que adotamos em laboratório para permitir a discriminação simultânea de diferentes populações do SNC, células vivas/mortas ou positividade para repórteres fluorescentes, como proteína fluorescente verde ou corante da rodamina. Ao aplicar esse fluxo de análise citométrica, podemos comparar diferentes métodos de processamento de tecidos, ou seja, PD versus DH, em termos de preservação da viabilidade celular e rendimentos de diferentes tipos de células.
Os detalhes que fornecemos aqui podem instruir a decisão sobre o protocolo de homogeneização e a combinação de anticorpos a usar no painel de citometria de fluxo, com base no tipo específico de interesse celular e nas análises a jusante (por exemplo, sensível à temperatura aplicações, rastreamento de marcadores fluorescentes específicos, cultura in vitro, análises funcionais).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um protocolo para a co-purificação e análise citométrica de fluxo simultâneo de algumas das células CNS mais relevantes do cérebro do rato e da medula espinhal. Tradicionalmente, análises histológicas têm sido aplicadas para descrever a distribuição de nanopartículas ou a eficiência de transdução de vetores virais no SNC5,13,ou para fornecer insights sobre as alterações morfológicas e moleculares que ocorrem em tipos específic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado por fundos start-up do Boston Children’s Hospital para A.B., ALSA grant nr. 17-IIP-343 a M.P., e o Escritório do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde através do Programa de Pesquisa de Esclerose Lateral Amiotrófica o Prêmio Nº. W81XWH-17-1-0036 a M.P. Reconhecemos o Núcleo de Citometria de Fluxo DFCI para suporte técnico.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
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