Caratterizzazione citometrica a flusso simultaneo di più tipi di cellule recuperate dal cervello del mouse/cavo spinale attraverso diversi metodi di omogeneizzazione
Summary
Vi presentiamo un metodo di citometria di flusso per identificare contemporaneamente diversi tipi di cellule recuperate dal cervello del topo o dal midollo spinale. Questo metodo potrebbe essere sfruttato per isolare o caratterizzare le popolazioni di cellule pure nelle malattie neurodegenerative o per quantificare l’estensione del targeting cellulare sulla somministrazione in vivo di vettori virali o nanoparticelle.
Abstract
I recenti progressi nelle scienze dei vettori virali e dei nanomateriali hanno aperto la strada a nuovi approcci all’avanguardia per studiare o manipolare il sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, un’ulteriore ottimizzazione di queste tecnologie trarrebbe vantaggio da metodi che consentano una rapida determinazione e una snellimento della portata del SNC e del targeting specifico per le cellule sulla somministrazione di vettori virali o nanoparticelle nel corpo. Qui, presentiamo un protocollo che sfrutta l’alta produttività e le capacità multiplexing della citometria di flusso per consentire una semplice quantificazione di diversi sottotipi di cellule isolati dal cervello del topo o dal midollo spinale, vale a dire microglia/macrofagi, linfociti, astrociti, oligodendrociti, neuroni e cellule endoteliali. Applichiamo questo approccio per evidenziare le differenze critiche tra due metodi di omogeneizzazione dei tessuti in termini di resa cellulare, vitalità e composizione. Questo potrebbe istruire l’utente a scegliere il metodo migliore a seconda del tipo di cella o dei tipi di cella di interesse e dell’applicazione specifica. Questo metodo non è adatto per l’analisi della distribuzione anatomica, poiché il tessuto è omogeneizzato per generare una sospensione a cella singola. Tuttavia, permette di lavorare con cellule vitali e può essere combinato con lo smistamento cellulare, aprendo la strada a diverse applicazioni che potrebbero espandere il repertorio di strumenti nelle mani del neuroscienziato, che vanno dall’istituzione di colture primarie derivate da popolazioni di cellule pure, ad analisi gene-expression e saggi biochimici o funzionali su sottotipi cellulari ben definiti nel contesto di malattie neurodegenerative, sul trattamento farmacologico o sulla terapia genica.
Introduction
Le tecnologie di somministrazione di geni e farmaci (come vettori virali e nanoparticelle) sono diventate un potente strumento che può essere applicato per ottenere migliori informazioni su percorsi molecolari specifici alterati nelle malattie neurodegenerative e per lo sviluppo di approcci terapeutici innovativi1,2,3. L’ottimizzazione di questi strumenti si basa sulla quantificazione di: (1) l’entità della penetrazione nel SNC su diverse vie di somministrazione e (2) targeting di specifiche popolazioni cellulari. Le analisi istologiche sono di solito applicate per visualizzare geni reporter fluorescenti o nanoparticelle fluorescenti in diverse aree del SNC e in diversi tipi di cellule, identificate dall’immunostaining per specifici marcatori cellulari4,5. Anche se questo approccio fornisce informazioni preziose sulla biodistribuzione degli strumenti di parto genico o di somministrazione di farmaci somministrati, la tecnica può richiedere molto tempo e un’intensa attività perché richiede: (1) fissazione dei tessuti, crioconservazione o pastura-incorporazione e affettatura; (2) colorazione per marcatori cellulari specifici che a volte richiedono il recupero dell’antigene; (3) acquisizione mediante microscopia a fluorescenza, che di solito consente l’analisi di un numero limitato di marcatori diversi all’interno dello stesso esperimento; (4) l’elaborazione delle immagini per consentire una corretta quantificazione del segnale di interesse.
La citometria di flusso è diventata una tecnica ampiamente utilizzata che sfrutta marcatori fluorescenti molto specifici per consentire non solo una rapida valutazione quantitativa di diversi fenotipi cellulari nelle sospensioni cellulari, basata sull’espressione di antigeni superficiali o intracellulari, ma anche misurazioni funzionali (ad esempio, tasso di apoptosi, proliferazione, analisi del ciclo cellulare, ecc.). È inoltre possibile l’isolamento fisico delle cellule attraverso lo smistamento fluorescente delle cellule attivate, consentendo ulteriori applicazioni a valle (ad esempio, coltura cellulare, RNA, analisi biochimiche, ecc.) 6,7,8.
L’omogeneizzazione dei tessuti è un passo fondamentale necessario per ottenere una sospensione a singola cella per consentire valutazioni citometriche a flusso a valle affidabili e riproducibili. Sono stati descritti diversi metodi per l’omogeneizzazione del tessuto cerebrale adulto, principalmente con l’obiettivo di isolare le cellule di microglia9,10,11; possono essere classificati complessivamente in due categorie principali: (1) dissociazione meccanica, che utilizza la forza di macinazione o di taglio attraverso un omogeneizzatore Dounce (DH) per strappare le cellule dalle loro nicchie e formare una sospensione a singola cella relativamente omogenea, e (2) digestione enzimatica, che si basa sull’incubazione di pezzi di tessuto macinato a 37 gradi centigradi in presenza di enzimi proteolitici, come la prova o la papaina, favorendo la degradazione della matrice extracellulare per creare una sospensione cellulare abbastanza omogenea12.
Indipendentemente dal metodo utilizzato, si raccomanda una fase di purificazione dopo l’omogeneizzazione dei tessuti per rimuovere la mielina attraverso la centrifugazione su un gradiente di densità o per selezione magnetica9,12, prima di passare alle applicazioni a valle.
Qui, descriviamo un metodo di lavorazione dei tessuti basato sulla digestione della papaina (PD) seguito dalla purificazione su un gradiente di densità, ottimizzato per ottenere sospensioni cellulari eterogenee praticabili dal cervello del topo o dal midollo spinale in modo sensibile al tempo e adatto per la citometria di flusso. Inoltre, descriviamo un pannello di citometria a flusso a 9 colori e la strategia di gating che abbiamo adottato in laboratorio per consentire la discriminazione simultanea di diverse popolazioni di SNC, cellule vive /morte o positività per giornalisti fluorescenti come proteine fluorescenti verdi o coloranti di rodamina. Applicando questa analisi citometrica del flusso, possiamo confrontare diversi metodi di lavorazione dei tessuti, cioè PD contro DH, in termini di conservazione della vitalità cellulare e rendimenti di diversi tipi di cellule.
I dettagli che forniamo nel presente documento possono istruire la decisione sul protocollo di omogeneizzazione e sulla combinazione di anticorpi da utilizzare nel pannello della citometria di flusso, in base al tipo o alle specifiche cellule di interesse e alle analisi a valle (ad esempio, sensibili alla temperatura applicazioni, tracciamento di specifici marcatori fluorescenti, cultura in vitro, analisi funzionali).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un protocollo per la co-purificazione e l’analisi citometrica del flusso simultaneo di alcune delle cellule CNS più rilevanti dal cervello del topo e dal midollo spinale. Tradizionalmente, le analisi istologiche sono state applicate per descrivere la distribuzione delle nanoparticelle o l’efficienza di trasduzione dei vettori virali nel CNS5,13, o per fornire informazioni sui cambiamenti morfologici e molecolari che si verificano in specifici tip…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dai fondi di start-up del Boston Children’s Hospital ad A.B., ALSA grant nr. 17-IIP-343 a M.P., e l’Ufficio dell’Assistente Segretario della Difesa per gli Affari Sanitari attraverso il Programma di Ricerca Sulla Sclerosi Laterale Amiotrofica sotto il Premio n. da W81XWH-17-1-0036 a M.P. Riconosciamo DFCI Flow Cytometry Core per il supporto tecnico.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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