Samtidige flow Cytometrisk karakterisering af flere celletyper hentet fra mus hjerne/rygmarv gennem forskellige homogenisering metoder
Summary
Vi præsenterer en flow cytometri metode til at identificere samtidigt forskellige celletyper hentet fra mus hjerne eller rygmarv. Denne metode kan udnyttes til at isolere eller karakterisere rene cellepopulationer i neurodegenerative sygdomme eller til at kvantificere omfanget af celle målretning ved in vivo administration af virale vektorer eller nanopartikler.
Abstract
Nylige fremskridt inden for viral vektor og nanomateriale Sciences har banet vejen for nye banebrydende tilgange til at undersøge eller manipulere centralnervesystemet (CNS). Yderligere optimering af disse teknologier vil imidlertid drage fordel af metoder, som muliggør hurtig og strømlinet bestemmelse af omfanget af CNS og celle specifik målretning efter administration af virale vektorer eller nanopartikler i kroppen. Her præsenterer vi en protokol, der udnytter de høje gennemløb og multiplexing kapaciteter af flow flowcytometri til at tillade en enkel kvantificering af forskellige celle undertyper isoleret fra mus hjerne eller rygmarv, nemlig microglia/makrofager, lymfocytter, astrocytter, oligodendrocytter, neuroner og endotelceller. Vi anvender denne fremgangsmåde til at fremhæve kritiske forskelle mellem to vævshomogenisering metoder med hensyn til celle udbytte, levedygtighed og sammensætning. Dette kunne instruere brugeren til at vælge den bedste metode afhængigt af celletype (r) af interesse og det specifikke program. Denne metode er ikke egnet til analyse af anatomisk fordeling, da vævet er homogeniseret til at generere en enkelt cellesuspension. Men det giver mulighed for at arbejde med levedygtige celler, og det kan kombineres med celle sortering, åbning af vejen for flere applikationer, der kunne udvide repertoiret af værktøjer i hænderne på neurovidenskabs manden, lige fra etablering af primære kulturer afledt af ren cellepopulationer, til genekspression analyser og biokemiske eller funktionelle assays på veldefinerede celle undertyper i forbindelse med neurodegenerative sygdomme, ved farmakologisk behandling eller genterapi.
Introduction
Teknologier til levering af gener og stoffer (såsom virale vektorer og nanopartikler) er blevet et effektivt værktøj, der kan anvendes til at opnå bedre indsigt i specifikke molekylære veje, som er ændret i neurodegenerative sygdomme, og til udvikling af innovative terapeutiske tilgange1,2,3. Optimering af disse værktøjer afhænger af kvantificering af: (1) omfanget af indtrængning i CNS på forskellige administrationsveje og (2) målretning af specifikke cellepopulationer. Histologiske analyser anvendes sædvanligvis til at visualisere fluorescerende reporter gener eller fluorercently-mærkede nanopartikler i forskellige CNS-områder og på tværs af forskellige celletyper, identificeret ved immun farvning for specifikke celle markører4,5. Selv om denne fremgangsmåde giver værdifulde oplysninger om biodistributionen af det administrerede gen-eller lægemiddel leverings værktøj, kan teknikken være tidskrævende og arbejdskrævende, da den kræver: (1) vævs fiksering, kryopræservering eller paraffin-indlejring og udskæring; (2) farvning for specifikke cellulære markører, der sommetider kræver antigen hentning; 3) erhvervelse ved Fluorescens mikroskopi, som sædvanligvis gør det muligt at analysere et begrænset antal forskellige markører inden for samme eksperiment (4) billedbehandling for at muliggøre korrekt kvantificering af interesse signalet.
Flowcytometri er blevet en meget anvendt teknik, der udnytter meget specifikke fluorescerende markører til ikke blot at tillade en hurtig kvantitativ vurdering af forskellige celle fænotyper i celle suspensioner baseret på ekspression af overflade eller intracellulære antigener, men også funktionelle målinger (f. eks. apoptose, proliferation, celle cyklus analyse osv.). Fysisk isolation af celler ved hjælp af fluorescerende aktiveret celle sortering er også muligt, hvilket giver mulighed for yderligere downstream-applikationer (f. eks. cellekultur, RNAseq, biokemiske analyser osv.) 6,7,8.
Vævshomogenisering er et afgørende skridt, der er nødvendigt for at opnå en enkelt cellesuspension for at tillade pålidelige og reproducerbare downstream flow cytometriske evalueringer. Forskellige metoder er blevet beskrevet for voksne hjernevæv homogenisering, hovedsagelig med det formål at isolere microglia celler9,10,11; de kan generelt inddeles i to hovedkategorier: (1) mekanisk dissociation, som anvender slibe-eller klippe kraft gennem en Dounce-homogenisator (DH) til at rive celler fra hinanden fra deres nicher og danner en relativt homogen enkelt cellesuspension, og (2) enzymatisk fordøjelse, som er afhængig af inkubation af hakket væv klumper ved 37 °C i nærværelse af Proteolytiske enzymer, såsom trypsin eller papain, favorisere nedbrydningen af den ekstracellulære matrix til at skabe en temmelig homogeniseret cellesuspension12.
Uanset hvilken metode der anvendes, anbefales et rensningstrin efter vævshomogenisering for at fjerne myelin gennem centrifugering på en tæthed gradient eller ved magnetisk valg9,12, før du flytter til downstream-applikationer.
Her beskriver vi en vævs behandlingsmetode baseret på papain fordøjelse (PD) efterfulgt af rensning på en tæthed gradient, optimeret til at opnå levedygtige heterogene celle suspensioner fra musehjerne eller rygmarv i en tidsfølsom måde og egnet til flow cytometry. Desuden beskriver vi en 9-Color flow flowcytometri panel og gating strategi, vi vedtog i laboratoriet for at muliggøre samtidig diskrimination af forskellige CNS-populationer, levende/døde celler eller positivitet for fluorescerende journalister såsom grøn fluorescerende protein eller b farvestof. Ved at anvende denne flow cytometrisk analyse, vi kan sammenligne forskellige metoder til vævs behandling, dvs, PD versus DH, med hensyn til bevarelse af cellulære levedygtighed og udbytter af forskellige celletyper.
De oplysninger, vi giver heri, kan instruere beslutning om homogenisering protokol og antistof kombination til brug i flow flowcytometri panel, baseret på den specifikke celletype (r) af interesse og downstream analyser (f. eks temperatur-følsomme anvendelser, sporing af specifikke fluorescerende markører, in vitro-kultur, funktionelle analyser).
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri beskriver vi en protokol for Co-oprensning og samtidige flow cytometrisk analyse af nogle af de mest relevante CNS celler fra mus hjerne og rygmarv. Traditionelt er der anvendt histologiske analyser til at beskrive fordelingen af nanopartikler eller transduktiviteten af virale vektorer i CNS5,13eller til at give indsigt i morfologiske og molekylære forandringer, der forekommer i specifikke celletyper under en patologi eller ved farmakologisk behandling<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af Boston children’s Hospital start-up midler til A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 til M.P., og kontoret for den assisterende forsvarsminister for Sundhedsanliggender gennem Amyotrophic lateral sklerose Research program under Award No. W81XWH-17-1-0036 til M.P. Vi anerkender DFCI flow cytometry Core for teknisk support.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
