توصيف التدفق الخلوي المتزامن لأنواع الخلايا المتعددة التي تم استردادها من الدماغ/الحبل الشوكي من خلال أساليب تجانس مختلفه
Summary
نقدم طريقه قياس التدفق الخلوي للتعرف علي أنواع مختلفه من الخلايا التي يتم استردادها من دماغ الماوس أو الحبل الشوكي في نفس الوقت. ويمكن استغلال هذه الطريقة لعزل أو توصيف مجموعات الخلايا النقية في الامراض التنكسية العصبية أو لقياس مدي استهداف الخلايا في الاداره المجرية لنواقل أو جسيمات نانويه فيروسية.
Abstract
وقد فتحت التطورات الاخيره في مجال النواقل الفيروسية والعلوم النانوماتيرياله الطريق امام نهج متطورة جديده للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي أو التلاعب به (CNS). ومع ذلك ، فان الاستفادة المثلي من هذه التكنولوجيات ستستفيد من الأساليب التي تسمح بالتحديد السريع والمبسط لمدي التركيز العصبي الخلوي والاستهداف الخاص بالخلايا علي أداره النواقل الفيروسية أو الجسيمات النانويه في الجسم. هنا ، نقدم البروتوكول الذي يستفيد من الانتاجيه العالية وقدرات الإرسال المتعدد لقياس التدفق الخلوي للسماح بالتحديد الكمي المباشر للأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا المعزولة عن دماغ الماوس أو الحبل الشوكي ، اي الخلايا الصغيرة/الضامة ، اللمفاويات ، استروسينتيس نحن نطبق هذا النهج لتسليط الضوء علي الاختلافات الحاسمة بين طريقتين تجانس الانسجه من حيث الغلة الخلية ، والقدرة علي البقاء والتكوين. وهذا يمكن ان يرشد المستخدم لاختيار أفضل طريقه اعتمادا علي نوع (s) الخلية من الفائدة وتطبيق معين. هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل التوزيع التشريحي ، لان النسيج متجانس لتوليد تعليق خليه واحده. ومع ذلك ، فانه يسمح للعمل مع خلايا قابله للحياة وانه يمكن الجمع بين الخلية الفرز ، فتح الطريق امام العديد من التطبيقات التي يمكن ان توسع ذخيرة الاداات في ايدي الأعصاب ، بدءا من إنشاء الثقافات الاوليه المستمدة من الخلايا النقية ، إلى تحليلات التعبير الجيني والاختبارات البيوكيميائية أو الوظيفية علي الأنواع الفرعية المحددة جيدا في سياق امراض الأعصاب
Introduction
أصبحت تقنيات توصيل الجينات والادويه (مثل النواقل الفيروسية والجسيمات النانويه) أداه قويه يمكن تطبيقها للحصول علي رؤى أفضل حول المسارات الجزيئية المحددة التي تم تغييرها في امراض الأعصاب ولتطوير الطرق العلاجية المبتكرة1،2،3. وتعتمد الاستفادة المثلي من هذه الاداات علي القياس الكمي لما يلي: (1) مدي التغلغل في الجهاز العصبي العام عند طرق الاداره المختلفة و (2) استهداف فئات معينه من الخلايا. وعاده ما يتم تطبيق التحليلات النسيجية لتصور الجينات مراسل الفلورسنت أو فلوريسسينتلي الموسومة النانويه في مختلف المناطق العصبية وعبر أنواع الخلايا المختلفة ، التي حددتها المناعية لعلامات خليه محدده4،5. وعلي الرغم من ان هذا النهج يوفر معلومات قيمه عن التوزيع الإحيائي للجينات التي تدار بالجينات أو أدوات تسليم المخدرات ، فان هذه التقنية يمكن ان تستغرق وقتا طويلا وتكون كثيفه العمالة لأنها تتطلب: (1) تثبيت الانسجه ، أو الحفظ بالتبريد ، أو تضمين البارافين وتقطيعها ؛ (2) تلطيخ لعلامات خلوية محدده تتطلب أحيانا استرجاع مستضد ؛ (3) الاستحواذ عن طريق المجهر الفلوري ، الذي يسمح عاده بتحليل عدد محدود من العلامات المختلفة في نفس التجربة ؛ (4) معالجه الصور للسماح بالتحديد الكمي المناسب لاشاره الفائدة.
وقد أصبح التدفق الخلوي تقنيه تستخدم علي نطاق واسع والتي تستفيد من علامات الفلورسنت محدده جدا للسماح ليس فقط التقييم الكمي السريع لمختلف الظواهر الخلوية في تعليق الخلية ، استنادا إلى التعبير عن المستضدات السطحية أو داخل الخلايا ، ولكن أيضا قياسات وظيفية (مثل معدل المبرمج ، والانتشار ومن الممكن أيضا العزل المادي للخلايا من خلال فرز خلايا الفلورسنت المنشطة ، مما يسمح بالمزيد من التطبيقات النهائية (علي سبيل المثال ، ثقافة الخلايا ، RNAseq ، التحاليل البيوكيميائية الخ) 6،7،8.
تجانس الانسجه هو خطوه حاسمه ضرورية للحصول علي تعليق خليه واحده للسماح موثوق بها وقابله للتكرار التقييمات الخلوية تدفق المصب. وقد وصفت طرق مختلفه لتجانس انسجه المخ الكبار ، وذلك أساسا بهدف عزل الخلايا الدقيقة الصغرى9،10،11؛ ويمكن تصنيفها بشكل عام في فئتين رئيسيتين: (1) التفكك الميكانيكي ، الذي يستخدم الطحن أو القص القوه من خلال الخالط Dounce (DH) لتمزيق الخلايا من منافذها وتشكيل تعليق خليه واحده متجانسة نسبيا ، و (2) الهضم الانزيمي ، الذي يعتمد علي احتضان قطع الانسجه المفرومة في 37 درجه مئوية في وجود الانزيمات البروتينية ، مثل التريبسين أو بابين ، لصالح تدهور المصفوفة خارج الخلية لإنشاء تعليق خليه متجانسة إلى حد ما12.
بغض الفضل عن الطريقة التي يتم استخدامها ، ينصح خطوه تنقيه بعد تجانس الانسجه لأزاله الميلين من خلال طرد علي التدرج الكثافة أو عن طريق اختيار المغناطيسي9،12، قبل الانتقال إلى التطبيقات المصب.
هنا ، ونحن وصف طريقه معالجه الانسجه علي أساس الهضم بابين (PD) تليها تنقيه علي التدرج الكثافة ، الأمثل للحصول علي تعليق الخلايا غير المتجانسة قابله للحياة من الدماغ الماوس أو الحبل الشوكي في طريقه حساسة للوقت ومناسبه لقياس التدفق الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فاننا وصف لوحه التدفق الخلوي 9 لون واستراتيجية النابضة التي اعتمدناها في المختبر للسماح التمييز في وقت واحد من مختلف السكان CNS ، والخلايا الحية/الميتة أو الايجابيه للصحفيين الفلورسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر أو صبغ الرومين. من خلال تطبيق هذا التحليل الخلوي التدفق ، يمكننا مقارنه الطرق المختلفة لمعالجه الانسجه ، اي PD مقابل DH ، من حيث الحفاظ علي القدرة الخلوية والغلة من أنواع الخلايا المختلفة.
التفاصيل التي نقدمها هنا يمكن ان توعز قرار بشان بروتوكول التجانس وتركيبه الأجسام المضادة لاستخدامها في لوحه تدفق الخلوي ، استنادا إلى نوع الخلية المحددة (ق) من الفائدة والتحليلات المصب (علي سبيل المثال ، حساسة لدرجه الحرارة التطبيقات ، وتتبع علامات الفلورسنت محدده ، في المختبر الثقافة ، والتحليلات الوظيفية).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن وصف بروتوكول لتنقيه المشتركة والمتزامنة تحليل التدفق الخلوي لبعض الخلايا العصبية الأكثر صله من الدماغ الماوس والحبل الشوكي. تقليديا ، تم تطبيق التحليلات النسيجية لوصف توزيع الجسيمات النانويه أو كفاءه المحولات الفيروسية في CNS5،13، أو لتوفير رؤى حول …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل مستشفي الأطفال بوسطن لبدء الأموال إلى A.B., ALSA منحه nr. IIP-343 إلى عضو البرلمان ، ومكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية من خلال برنامج بحوث التصلب الجانبي الضموري تحت الجائزة رقم W81XWH-17-1-0036 إلى عضو البرلمان ونحن نعترف DFCI تدفق الخلوية الاساسيه للدعم التقني.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
