通过不同的均质化方法从小鼠大脑/脊髓中检索到的多种细胞类型的同步流细胞测量特征
Summary
我们提出了一种流式细胞测定方法，用于识别从小鼠大脑或脊髓中检索到的不同细胞类型。该方法可用于分离或描述神经退行性疾病中的纯细胞群，或量化细胞靶向在体内给病毒载体或纳米粒子的靶向范围。
Abstract
病毒载体和纳米材料科学的最新进展为研究或操纵中枢神经系统（CNS）的新方法开辟了道路。然而，这些技术的进一步优化将受益于在体内病毒载体或纳米粒子的培养后，能够快速和简化地确定中枢神经系统和细胞特定靶向的范围的方法。在这里，我们提出一个协议，利用流式细胞学的高通量和多路复用功能，允许从小鼠大脑或脊髓中分离的不同细胞亚型，即微胶质/巨噬细胞、淋巴细胞、星细胞、寡核苷酸细胞、神经元和内皮细胞进行直接定量。我们应用这种方法来突出两个组织均质方法在细胞产量、活力和组成方面的重要差异。这可以指示用户根据感兴趣的单元格类型和特定应用程序选择最佳方法。此方法不适合分析解剖分布，因为组织是同质化的，以产生单细胞悬浮液。然而，它允许与活细胞一起工作，它可以与细胞分类相结合，为几种应用开辟了道路，这些应用可以扩大神经科学家手中的工具范围，从建立从纯细胞种群衍生的初级培养物，到基因表达分析以及神经退行性疾病背景下明确定义的细胞亚型的基因表达或功能测定，在药物治疗或基因治疗时。
Introduction
基因和药物输送技术（如病毒载体和纳米粒子）已成为一个强大的工具，可以应用来获得对神经退行性疾病中改变的特定分子途径的更好见解，并开发创新的治疗方法1，2，3。这些工具的优化取决于以下方面：（1） 不同管理途径在中枢神经系统的渗透程度，以及（2） 针对特定细胞群。组织学分析通常应用于可视化荧光报告基因或荧光标记纳米粒子在不同的CNS区域和不同的细胞类型，通过免疫染色特定细胞标记4，5识别。尽管这种方法提供了关于施用基因或药物输送工具的生物分布的宝贵信息，但该技术可能非常耗时和耗费大量人力，因为它需要：（1） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 有时需要抗原检索的特定细胞标记物的染色;（3） 通过荧光显微镜采集，通常允许在同一实验中分析有限数量的不同标记;（4）图像处理，允许对感兴趣的信号进行适当的量化。
流式细胞学已成为一种广泛使用的技术，它利用非常特殊的荧光标记，不仅允许根据表面或细胞内抗原的表达对细胞悬浮液中的不同细胞表型进行快速定量评估，而且还允许功能测量（例如，凋亡率、增殖率、细胞周期分析等）。也可以通过荧光活化细胞分类对细胞进行物理分离，从而进一步进行下游应用（例如，细胞培养、RNAeq、生化分析等）6，7，8.
组织均质化是获得单细胞悬浮液以进行可靠和可重复的下游流细胞测量的关键步骤。对成人脑组织均质化有不同的方法，主要目的是分离微胶质细胞9、10、11;它们可分为两大类：（1）机械分离， 它使用研磨或剪切力通过Dce均质剂（DH）撕开细胞从他们的利基，并形成一个相对均质的单细胞悬浮液，和（2）酶消化，它依赖于在37°C的分块组织块在存在蛋白酶，如胰蛋白酶，如胰蛋白酶，如胰蛋白酶，有利于细胞外基质的降解，以创建一个相当均质的细胞悬浮液12。
无论使用哪种方法，在组织均质化后，建议通过密度梯度上的离心或磁选择9、12去除骨髓，然后再转移到下游应用。
在这里，我们描述了一种基于木瓜素消化（PD）的组织处理方法，随后在密度梯度上进行纯化，经过优化，以时间敏感的方式从小鼠大脑或脊髓获得可行的异质细胞悬浮液，并适合流动细胞学。此外，我们描述了一个9色流细胞测定面板和我们在实验室采用的浇注策略，允许同时区分不同的CNS人群、活/死细胞或荧光报告机的积极性，如绿色荧光蛋白或罗达明染料。通过应用这种流式细胞测定分析，我们可以比较不同的组织处理方法，即PD与DH，在保持细胞活力和不同细胞类型的产量方面。
我们本文提供的细节可以指导根据感兴趣的特定细胞类型和下游分析（例如，温度敏感度）在流式细胞测定面板中使用的同质化协议和抗体组合。应用、特定荧光标记的跟踪、体外培养、功能分析）。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍一种协议，用于对小鼠大脑和脊髓中一些最相关的CNS细胞进行共纯化和并发流细胞学分析。传统上，组织学分析已应用于描述纳米粒子的分布或病毒载体在CNS5，13的转导效率，或提供在病理学或药理治疗期间特定细胞类型发生的形态和分子变化的见解14。然而，组织学缺乏过程性，由于可以同时分析的标记数量有限，因此无法…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由波士顿儿童医院的启动基金资助给A.B.，ALSA赠款nr.17-IIP-343 到 M.P.，以及助理国防部长办公室通过肌萎缩性侧索硬化研究计划，根据第 No.W81XWH-17-1-0036 到 M.P.我们感谢 DFCI 流式细胞学核心的技术支持。
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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