Caractérisation cytométrique simultanée des types de cellules multiples récupérées du cerveau de la souris / moelle épinière grâce à différentes méthodes d'homogénéisation
Summary
Nous présentons une méthode de cytométrie de flux pour identifier simultanément différents types de cellules récupérées du cerveau de souris ou de la moelle épinière. Cette méthode pourrait être exploitée pour isoler ou caractériser les populations cellulaires pures dans les maladies neurodégénératives ou pour quantifier l’étendue du ciblage cellulaire sur l’administration in vivo de vecteurs viraux ou de nanoparticules.
Abstract
Les progrès récents des sciences des vecteurs viraux et des nanomatériaux ont ouvert la voie à de nouvelles approches de pointe pour étudier ou manipuler le système nerveux central (SNC). Cependant, une optimisation plus poussée de ces technologies bénéficierait de méthodes permettant une détermination rapide et rationalisée de l’étendue du SNC et du ciblage cellulaire spécifique à l’administration de vecteurs viraux ou de nanoparticules dans l’organisme. Ici, nous présentons un protocole qui tire parti des capacités de haut débit et de multiplexage de la cytométrie du débit pour permettre une simple quantification de différents sous-types cellulaires isolés du cerveau de souris ou de la moelle épinière, à savoir des microglies/macrophages, des lymphocytes, des astrocytes, des oligodendrocytes, des neurones et des cellules endothéliales. Nous appliquons cette approche pour mettre en évidence les différences critiques entre deux méthodes d’homogénéisation des tissus en termes de rendement cellulaire, de viabilité et de composition. Cela pourrait demander à l’utilisateur de choisir la meilleure méthode en fonction du type de cellule (s) d’intérêt et de l’application spécifique. Cette méthode n’est pas adaptée à l’analyse de la distribution anatomique, puisque le tissu est homogénéisé pour générer une suspension unicellulaire. Cependant, il permet de travailler avec des cellules viables et il peut être combiné avec le tri cellulaire, ouvrant la voie à plusieurs applications qui pourraient élargir le répertoire des outils dans les mains du neuroscientifique, allant de l’établissement de cultures primaires dérivées de populations cellulaires pures, à des analyses d’expression génique et des essais biochimiques ou fonctionnels sur des sous-types cellulaires bien définis dans le contexte des maladies neurodégénératives, sur le traitement pharmacologique ou la thérapie génique.
Introduction
Les technologies d’administration de gènes et de médicaments (comme les vecteurs viraux et les nanoparticules) sont devenues un outil puissant qui peut être appliqué pour obtenir de meilleures connaissances sur des voies moléculaires spécifiques modifiées dans les maladies neurodégénératives et pour le développement d’approches thérapeutiques innovantes1,2,3. L’optimisation de ces outils repose sur la quantification de : (1) l’étendue de la pénétration du SNC sur différents axes d’administration et (2) le ciblage de populations cellulaires spécifiques. Les analyses histologiques sont généralement appliquées pour visualiser les gènes des reporters fluorescents ou les nanoparticules étiquetées fluorescentes dans différentes zones du SNC et dans différents types de cellules, identifiées par l’immunostaining pour des marqueurs cellulaires spécifiques4,5. Même si cette approche fournit des informations précieuses sur la biodistribution du gène administré ou des outils de livraison de médicaments, la technique peut être longue et laborieuse, car elle nécessite : (1) fixation des tissus, cryoconservation ou encastrage et découpage de paraffine; (2) la coloration de marqueurs cellulaires spécifiques nécessitant parfois la récupération d’antigènes; (3) acquisition par microscopie fluorescence, qui permet habituellement l’analyse d’un nombre limité de marqueurs différents au sein d’une même expérience; (4) le traitement d’image pour permettre une quantification appropriée du signal d’intérêt.
La cytométrie de flux est devenue une technique largement utilisée qui tire parti de marqueurs fluorescents très spécifiques pour permettre non seulement une évaluation quantitative rapide de différents phénotypes cellulaires dans les suspensions cellulaires, basée sur l’expression d’antigènes de surface ou intracellulaires, mais aussi des mesures fonctionnelles (p. ex., taux d’apoptose, prolifération, analyse du cycle cellulaire, etc.). L’isolement physique des cellules par le tri des cellules activées fluorescentes est également possible, permettant d’autres applications en aval (p. ex., culture cellulaire, RNAseq, analyses biochimiques, etc.) 6,7,8.
L’homogénéisation tissulaire est une étape critique nécessaire pour obtenir une suspension cellulaire unique afin de permettre des évaluations cytométriques fiables et reproductibles en aval. Différentes méthodes ont été décrites pour l’homogénéisation adulte de cerveau-tissu, principalement dans le but d’isoler des cellulesdemicroglie 9,10,11; ils peuvent être classés dans l’ensemble dans deux catégories principales : (1) dissociation mécanique, qui utilise la force de broyage ou de cisaillement à travers un homogénéisateur Dounce (DH) pour déchirer les cellules de leurs niches et former une suspension à cellule unique relativement homogénéisée, et (2) la digestion enzymatique, qui repose sur l’incubation de morceaux de tissu haché à 37 oC en présence d’enzymes protéolytiques, telles que la trypsine ou la papaïne, favorisant la dégradation de la matrice extracellulaire pour créer une suspension cellulaire assez homogène12.
Quelle que soit la méthode utilisée, une étape de purification est recommandée après l’homogénéisation des tissus pour enlever la myéline par centrifugation sur un gradient de densité ou par sélection magnétique9,12, avant de passer aux applications en aval.
Ici, nous décrivons une méthode de traitement de tissu basée sur la digestion de papain (PD) suivie de la purification sur un gradient de densité, optimisée pour obtenir des suspensions hétérogènes viables de cellules du cerveau de souris ou de la moelle épinière d’une manière temporelle et appropriée pour la cytométrie d’écoulement. En outre, nous décrivons un panneau de cytométrie de flux de 9 couleurs et la stratégie de gating que nous avons adoptée en laboratoire pour permettre la discrimination simultanée de différentes populations de SNC, cellules vivantes/mortes ou positivité pour les journalistes fluorescents tels que la protéine fluorescente verte ou la teinture de rhodamine. En appliquant cette analyse cytométrique de flux, nous pouvons comparer différentes méthodes de traitement des tissus, c’est-à-dire la DP par rapport à la DH, en termes de préservation de la viabilité cellulaire et des rendements de différents types de cellules.
Les détails que nous fournissons dans les présentes peuvent indiquer la décision sur le protocole d’homogénéisation et la combinaison d’anticorps à utiliser dans le panneau de cytométrie de débit, basé sur le type de cellule spécifique (s) d’intérêt et les analyses en aval (par exemple, la température sensible applications, suivi de marqueurs fluorescents spécifiques, culture in vitro, analyses fonctionnelles).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous décrivons un protocole pour la co-purification et l’analyse cytométrique simultanée de flux de quelques-unes des cellules les plus pertinentes de CNS du cerveau de souris et de la moelle épinière. Traditionnellement, des analyses histologiques ont été appliquées pour décrire la distribution des nanoparticules ou l’efficacité de la transduction des vecteurs viraux dans le SNC5,13, ou pour fournir des informations sur les changements morphologiqu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par les fonds de démarrage de l’Hôpital pour enfants de Boston à A.B., ALSA subvention nr. 17-IIP-343 à M.P., et le Bureau du Sous-Secrétaire à la Défense pour les affaires de santé par le biais du programme de recherche sur la sclérose latérale amyotrophique dans le cadre du Prix No. W81XWH-17-1-0036 à M.P. Nous reconnaissons DFCI Flow Cytometry Core pour son support technique.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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