Одновременное циклометрическое использование потока нескольких типов клеток, извлеченных из мозга мыши / спинного мозга с помощью различных методов гомогенизации
Summary
Мы представляем метод цитометрии потока для идентификации одновременно различных типов клеток, извлеченных из мозга мыши или спинного мозга. Этот метод может быть использован для изоляции или характеристики чистых популяций клеток при нейродегенеративных заболеваниях или для количественной оценки степени ориентации клеток на in vivo вирусных векторов или наночастиц.
Abstract
Недавние достижения в области вирусного вектора и наноматериальных наук открыли путь для новых передовых подходов к исследованию или манипулированию центральной нервной системой (ЦНС). Однако дальнейшая оптимизация этих технологий будет способствовать методам, позволяющим быстро и упорядочить определение степени ЦНС и клеточного таргетинга при приеме вирусных векторов или наночастиц в организме. Здесь мы представляем протокол, который использует высокую пропускную способность и мультиплексирование возможности цитометрии потока, чтобы позволить простой количественной оценки различных подтипов клеток, изолированных от мозга мыши или спинного мозга, а именно микроглии / макрофагов, лимфоцитов, астроцитов, олигодендроцитов, нейронов и эндотелиальных клеток. Мы применяем этот подход, чтобы подчеркнуть критические различия между двумя методами гомогенизации тканей с точки зрения урожайности клеток, жизнеспособности и состава. Это может поручить пользователю выбрать лучший метод в зависимости от типа ячейки (ы) интереса и конкретного приложения. Этот метод не подходит для анализа анатомического распределения, так как ткань гомогенизирована для создания одноклеточной суспензии. Тем не менее, это позволяет работать с жизнеспособными клетками и может быть объединена с клеточной сортировкой, открывая путь для нескольких приложений, которые могли бы расширить репертуар инструментов в руках нейробиолога, начиная от создания первичных культур, полученных из чистоклеточных популяций, до анализа генной экспрессии и биохимических или функциональных анализов на четко определенных подтипах клеток в контексте нейрогенеративных заболеваний, на фармакологическом лечении или генной терапии.
Introduction
Технологии доставки генов и лекарств (таких как вирусные векторы и наночастицы) стали мощным инструментом, который может быть применен, чтобы получить лучшее представление о конкретных молекулярных путей, измененных в нейродегенеративных заболеваний и для развития инновационных терапевтических подходов1,2,3. Оптимизация этих инструментов основывается на количественной оценке: (1) степень проникновения в ЦНС на различных путях управления и (2) ориентации на конкретные популяции ячеек. Гистологические анализы обычно применяются для визуализации флуоресцентных генов репортера или флуоресцентно помеченных наночастиц в различных областях ЦНС и в различных типах клеток, выявленных иммуномаркировкой для конкретных маркеров клеток4,5. Несмотря на то, что этот подход предоставляет ценную информацию о биораспределении вводимых генов или инструментов доставки лекарств, этот метод может быть трудоемким и трудоемким, поскольку он требует: (1) фиксации тканей, криоконсервации или встраивания парафина и нарезки; (2) окрашивание для конкретных клеточных маркеров, иногда требующих поиска антигена; (3) приобретение флуоресценции микроскопии, которая обычно позволяет анализ ограниченного числа различных маркеров в рамках одного и того же эксперимента; (4) обработка изображений, чтобы обеспечить надлежащую количественную оценку сигнала интереса.
Цитометрия потока стала широко используемой техникой, которая использует очень специфические флуоресцентные маркеры, позволяющие не только быстрой количественной оценки различных клеточных фенотипов в клеточных суспензиях, основанных на экспрессии поверхностных или внутриклеточных антигенов, но и функциональных измерений (например, скорость апоптоза, пролиферания, анализ клеточного цикла и т.д.). Возможна также физическая изоляция клеток через флуоресцентную активированную сортировку клеток, что позволяет дополнительно приступить к применению ниже по течению (например, клеточная культура, РНК, биохимический анализ и т.д.) 6,7,8.
Ткань гомогенизации является критическим шагом, необходимым для получения одной подвески клеток, чтобы надежные и воспроизводимые вниз по течению потока цитометрических оценок. Различные методы были описаны для взрослых гомогенизации мозговой ткани, в основном с целью изоляции микроглии клеток9,10,11; они могут быть классифицированы в целом в двух основных категориях: (1) механическая диссоциация, которая использует шлифовальные или сдвига силы через Dounce гомогенизатор (DH), чтобы разорвать клетки из своих ниш и образуют относительно гомогенизированные одной клетки подвески, и (2) ферментативное пищеварение, которое опирается на инкубацию измельченных тканей куски при 37 градусов по Цельсию в присутствии протеолитических ферментов, таких как трипсин или папаин, в пользу деградации внеклеточной матрицы для создания довольно однородной клеточной суспензии12.
Независимо от того, какой метод используется, шаг очистки рекомендуется после гомогенизации тканей, чтобы удалить миелин через центрифугирование на градиент плотности или магнитным отбором9,12, перед переходом к приложениям вниз по течению.
Здесь мы описываем метод обработки тканей на основе пищеварения папанов (PD), а затем очищение на градиент плотности, оптимизированы для получения жизнеспособных неоднородных клеточных суспензий из мозга мыши или спинного мозга в чувствительных к времени образом и подходит для потока цитометрии. Кроме того, мы описываем 9-цветной цитометрии потока панели и gating стратегии мы приняли в лаборатории, чтобы позволить одновременной дискриминации различных популяций ЦНС, живых / мертвых клеток или положительность для флуоресцентных репортеров, таких как зеленый флуоресцентный белок или родамина красителя. Применяя этот цитометрический анализ потока, мы можем сравнить различные методы обработки тканей, т.е. PD против DH, с точки зрения сохранения жизнеспособности клеток и урожайности различных типов клеток.
Детали, которые мы предоставляем в данном проекте, могут поручить решение о протоколе гомогенизации и комбинации антител для использования в панели цитометрии потока, основанной на конкретном типе клеток (ы) интереса и анализе вниз по течению (например, чувствительных к температуре применения, отслеживание конкретных флуоресцентных маркеров, культура in vitro, функциональный анализ).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом мы описываем протокол для совместного очищения и одновременного цитометрического анализа потока некоторых из наиболее релевантных клеток ЦНС из мозга мыши и спинного мозга. Традиционно, гистологические анализы были применены для описания распределения наночастиц или трансду?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано Бостонской детской больницы стартовых средств для A.B., ALSA грант nr. 17-IIP-343 в М.П., и Управление помощника министра обороны по вопросам здравоохранения через амиотрофический боковой склероз исследовательской программы в соответствии с премией No. W81XWH-17-1-0036 до M.P. Мы признаем DFCI Flow Cytometry Core за техническую поддержку.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
