Caracterización citométrica de flujo simultáneo de múltiples tipos de células recuperadas del cerebro del ratón/cordón espinal a través de diferentes métodos de homogeneización
Summary
Presentamos un método de citometría de flujo para identificar simultáneamente diferentes tipos de células recuperadas del cerebro del ratón o de la médula espinal. Este método podría ser explotado para aislar o caracterizar las poblaciones de células puras en enfermedades neurodegenerativas o para cuantificar el alcance de la orientación celular a la administración in vivo de vectores virales o nanopartículas.
Abstract
Los recientes avances en las ciencias de vectores virales y nanomateriales han abierto el camino a nuevos enfoques de vanguardia para investigar o manipular el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, una mayor optimización de estas tecnologías se beneficiaría de métodos que permitan determinar rápida y agilizar el alcance del SNC y la orientación específica de las células en la administración de vectores virales o nanopartículas en el cuerpo. Aquí, presentamos un protocolo que aprovecha las capacidades de alto rendimiento y multiplexación de la citometría de flujo para permitir una cuantificación directa de diferentes subtipos celulares aislados del cerebro del ratón o de la médula espinal, a saber, microglia/macrophages, linfocitos, astrocitos, oligodendrocitos, neuronas y células endoteliales. Aplicamos este enfoque para resaltar las diferencias críticas entre dos métodos de homogeneización tisular en términos de rendimiento celular, viabilidad y composición. Esto podría indicar al usuario que elija el mejor método dependiendo de los tipos de celda de interés y la aplicación específica. Este método no es adecuado para el análisis de la distribución anatómica, ya que el tejido se homogeneiza para generar una suspensión de una sola célula. Sin embargo, permite trabajar con células viables y se puede combinar con la clasificación celular, abriendo el camino para varias aplicaciones que podrían ampliar el repertorio de herramientas en manos del neurocientífico, que van desde el establecimiento de cultivos primarios derivados de poblaciones de células puras, hasta análisis de expresión génica y ensayos bioquímicos o funcionales sobre subtipos celulares bien definidos en el contexto de enfermedades neurodegenerativas, sobre el tratamiento farmacológico o la terapia génica.
Introduction
Las tecnologías de generación de genes y fármacos (como los vectores virales y las nanopartículas) se han convertido en una poderosa herramienta que se puede aplicar para obtener mejores perspectivas sobre vías moleculares específicas alteradas en enfermedades neurodegenerativas y para el desarrollo de enfoques terapéuticos innovadores1,2,3. La optimización de estas herramientas se basa en la cuantificación de: (1) el grado de penetración en el SNC en diferentes vías de administración y (2) la focalización de poblaciones celulares específicas. Los análisis histológicos se aplican generalmente para visualizar genes de reporterofluorescentes o nanopartículas etiquetadas fluorescentes en diferentes áreas del SNC y en diferentes tipos de células, identificados por inmunomanchado para marcadores celulares específicos4,5. A pesar de que este enfoque proporciona información valiosa sobre la biodistribución del gen administrado o las herramientas de administración de fármacos, la técnica puede ser lenta e intensa en el trabajo de parto, ya que requiere: (1) fijación de tejidos, criopreservación o incrustación y corte de parafina; (2) la tinción de marcadores celulares específicos que a veces requieren la recuperación de antígenos; 3) adquisición por microscopía de fluorescencia, que normalmente permite el análisis de un número limitado de marcadores diferentes dentro del mismo experimento; (4) procesamiento de imágenes para permitir una cuantificación adecuada de la señal de interés.
La citometría de flujo se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada que aprovecha marcadores fluorescentes muy específicos para permitir no sólo una evaluación cuantitativa rápida de diferentes fenotipos celulares en suspensiones celulares, basada en la expresión de antígenos superficiales o intracelulares, sino también mediciones funcionales (por ejemplo, tasa de apoptosis, proliferación, análisis del ciclo celular, etc.). El aislamiento físico de las células a través de la clasificación de células fluorescentes activadas también es posible, lo que permite aplicaciones posteriores (por ejemplo, cultivo celular, ARNseq, análisis bioquímicos, etc.) 6,7,8.
La homogeneización de tejidos es un paso crítico necesario para obtener una suspensión de una sola célula que permita evaluaciones citométricas de flujo descendente fiables y reproducibles. Se han descrito diferentes métodos para la homogeneización cerebro-tejido adulto, principalmente con el objetivo de aislar las células de microglia9,10,11; pueden clasificarse en general en dos categorías principales: (1) disociación mecánica, que utiliza la fuerza de molienda o cizallamiento a través de un homogeneizador de Dounce (DH) para separar las células de sus nichos y formar una suspensión de una sola célula relativamente homogeneizada, y (2) la digestión enzimática, que se basa en la incubación de trozos de tejido picado a 37 oC en presencia de enzimas proteolíticas, como la trippsina o la papaína, favoreciendo la degradación de la matriz extracelular para crear una suspensión celular bastante homogeneizada12.
Independientemente del método que se utilice, se recomienda un paso de purificación después de la homogeneización del tejido para eliminar la mielina a través de la centrifugación en un gradiente de densidad o por selección magnética9,12, antes de pasar a las aplicaciones aguas abajo.
Aquí, describimos un método de procesamiento de tejido basado en la digestión de la papaína (PD) seguido de purificación en un gradiente de densidad, optimizado para obtener suspensiones celulares heterogéneas viables del cerebro del ratón o de la médula espinal de una manera sensible al tiempo y adecuada para la citometría de flujo. Además, describimos un panel de citometría de flujo de 9 colores y la estrategia de gating que adoptamos en el laboratorio para permitir la discriminación simultánea de diferentes poblaciones de SNC, células vivas/muertas o positividad para reporteros fluorescentes como proteína fluorescente verde o tinte de rodamina. Mediante la aplicación de este análisis citométrico de flujo, podemos comparar diferentes métodos de procesamiento de tejido, es decir, PD frente a DH, en términos de preservación de la viabilidad celular y rendimientos de diferentes tipos de células.
Los detalles que proporcionamos aquí pueden instruir la decisión sobre el protocolo de homogeneización y la combinación de anticuerpos para utilizar en el panel de citometría de flujo, basado en el tipo de celda específico de interés y los análisis aguas abajo (por ejemplo, sensible a la temperatura seguimiento de marcadores fluorescentes específicos, cultivo in vitro, análisis funcionales).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un protocolo para la co-purificación y el análisis citométrico de flujo simultáneo de algunas de las células del SNC más relevantes del cerebro del ratón y la médula espinal. Tradicionalmente, se han aplicado análisis histológicos para describir la distribución de nanopartículas o la eficiencia de transducción de vectores virales en el SNC5,13, o para proporcionar información sobre los cambios morfológicos y moleculares que se pro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por fondos de start-up del Boston Children’s Hospital a A.B., ALSA grant nr. 17-IIP-343 a M.P., y la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación de Esclerosis Lateral Amiotrófica bajo el Premio No. W81XWH-17-1-0036 a M.P. Reconocemos DFCI Flow Cytometry Core para soporte técnico.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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