Samtidig flödescytometrisk karakterisering av flera cell typer Hämtad från mushjärna/ryggmärg genom olika Homogeniseringsmetoder
Summary
Vi presenterar en flödescytometri metod för att identifiera samtidigt olika celltyper hämtas från mushjärna eller ryggmärg. Denna metod skulle kunna utnyttjas för att isolera eller karakterisera rena cellpopulationer i neurodegenerativa sjukdomar eller för att kvantifiera omfattningen av cell inriktningen vid in vivo-administrering av virala vektorer eller nanopartiklar.
Abstract
De senaste framstegen inom viral Vector och nanomaterial har öppnat vägen för nya banbrytande metoder för att undersöka eller manipulera centralanervsystemet (CNS). Men ytterligare optimering av dessa tekniker skulle gynnas av metoder som möjliggör snabb och strömlinjeformad bestämning av omfattningen av CNS och cellspecifik inriktning vid administrering av virala vektorer eller nanopartiklar i kroppen. Här presenterar vi ett protokoll som utnyttjar den höga genomströmningen och multiplexering kapacitet flödescytometri att möjliggöra en enkel kvantifiering av olika cell subtyper isolerade från mushjärna eller ryggmärg, nämligen microglia/makrofager, lymfocyter, astrocyter, oligodendrocyter, nervceller och endotelceller. Vi tillämpar denna metod för att belysa kritiska skillnader mellan två vävnads homogenisering metoder när det gäller cell utbyte, lönsamhet och sammansättning. Detta kan instruera användaren att välja den bästa metoden beroende på celltyp (er) av intresse och det specifika programmet. Denna metod lämpar sig inte för analys av anatomisk fördelning, eftersom vävnaden är homogeniserad för att generera en encellig suspension. Men det gör det möjligt att arbeta med livskraftiga celler och det kan kombineras med cell-sortering, öppna vägen för flera applikationer som kan utöka repertoaren av verktyg i händerna på neuroscientist, alltifrån etablering av primära kulturer som härrör från ren cellpopulationer, till gen-Expression analyser och biokemiska eller funktionella analyser på väldefinierade cell subtyper i samband med neurodegenerativa sjukdomar, vid farmakologisk behandling eller genterapi.
Introduction
Gen-och läkemedelsleverans teknik (såsom virusvektorer och nanopartiklar) har blivit ett kraftfullt verktyg som kan tillämpas för att få bättre insikter om specifika molekylära vägar förändrade i neurodegenerativa sjukdomar och för utveckling av innovativa terapeutiska metoder1,2,3. Optimering av dessa verktyg bygger på kvantifiering av: (1) omfattningen av penetration i CNS vid olika administreringsvägar och (2) inriktning av specifika cellpopulationer. Histologiska analyser används vanligtvis för att visualisera fluorescerande rapportgener eller fluorescerande-märkta nanopartiklar i olika CNS-områden och mellan olika celltyper, identifierade genom immunofärgning för specifika cell markörer4,5. Även om detta tillvägagångssätt ger värdefull information om biodistribution av den administrerade genen eller Drug-leveransverktyg, kan tekniken vara tidskrävande och arbetsintensiva eftersom det kräver: (1) vävnadsinfixering, kryopreservation eller paraffin-inbäddning och skivning; (2) färgning för specifika cellulära markörer ibland kräver antigen hämtning; (3) förvärv av fluorescensmikroskopi, som vanligtvis möjliggör analys av ett begränsat antal olika markörer inom samma experiment; (4) bildbehandling för att möjliggöra korrekt kvantifiering av signalen av intresse.
Flödescytometri har blivit en allmänt använd teknik som utnyttjar mycket specifika fluorescerande markörer för att möjliggöra inte bara en snabb kvantitativ utvärdering av olika cell fenotyper i cellsuspensioner, baserat på uttryck av yta eller intracellulära antigener, men också funktionella mätningar (t. ex. hastighet av apoptos, proliferation, cell cykel analys, etc.). Fysisk isolering av celler genom fluorescerande aktiverad cell sortering är också möjligt, vilket möjliggör ytterligare nedströms tillämpningar (t. ex. cellkultur, RNAseq, biokemiska analyser etc.) 6,7,8.
Vävnad homogenisering är ett kritiskt steg som krävs för att få en enda cellsuspension att möjliggöra tillförlitlig och reproducerbara nedströms flödescytometriska utvärderingar. Olika metoder har beskrivits för vuxna hjärnvävnad homogenisering, främst i syfte att isolera mikroglia celler9,10,11; de kan vara övergripande klassificeras i två huvudkategorier: (1) mekanisk dissociation, som använder slipning eller klippning kraft genom en Dounce Homogenisatorer (DH) att rippa isär celler från sina nischer och bildar en relativt homogeniserad enda cellsuspension, och (2) enzymatisk matsmältning, som förlitar sig på inkubation av malet vävnad bitar vid 37 ° c i närvaro av proteolytiska enzymer, såsom trypsin eller papain, gynnar nedbrytningen av den extracellulära matrisen för att skapa en ganska homogeniserad cellsuspension12.
Oavsett vilken metod som används, rekommenderas ett reningssteg efter vävnads homogenisering för att avlägsna myelin genom centrifugering på en densitetsgradient eller genom magnet val9,12, innan de övergår till nedströms applikationer.
Här beskriver vi en vävnads process metod baserad på papain matsmältningen (PD) följt av rening på en densitet gradient, optimerad för att få livskraftiga heterogena cellsuspensioner från mushjärna eller ryggmärg på ett tidskänsligt sätt och lämpar sig för flödescytometri. Dessutom beskriver vi en 9-färgton flödescytometri panel och den gating strategi vi antog i laboratoriet för att möjliggöra samtidig diskriminering av olika CNS populationer, levande/döda celler eller positivitet för fluorescerande reportrar såsom grönt fluorescerande protein eller rodamin färgämne. Genom att tillämpa denna flödescytometrisk analys kan vi jämföra olika metoder för vävnads bearbetning, dvs PD kontra DH, när det gäller bevarande av cellulär lönsamhet och utbyten av olika celltyper.
De uppgifter vi tillhandahåller häri kan instruera beslut om homogeniseringsprotokollet och antikropps kombinationen att använda i flödescytometri-panelen, baserat på den specifika celltypen (-erna) av intresse och efterföljande analyser (t. ex. temperaturkänsliga applikationer, spårning av specifika fluorescerande markörer, in vitro-kultur, funktionella analyser).
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri beskriver vi ett protokoll för samrening och samtidig flödescytometrisk analys av några av de mest relevanta CNS-cellerna från mushjärna och ryggmärg. Traditionellt har histologiska analyser tillämpats för att beskriva distributionen av nanopartiklar eller verkningsgraden hos virala vektorer i CNS5,13, eller för att ge insikter om morfologiska och molekylära förändringar som förekommer i specifika celltyper under en patologi eller vid farmakolo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades av Boston Children ‘ s Hospital start-up fonder till A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 till M.P., och kontoret för biträdande försvarsministern för hälsofrågor genom Amyotrofiska lateral skleros forsknings program under Award No. W81XWH-17-1-0036 till M.P. Vi erkänner DFCI Flow Cytometry Core för teknisk support.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
