Kontusjon spinal Cord skade via en mikrokirurgisk laminectomy i regenererende Axolotl
Summary
Dette manuskriptet presenterer protokoller for kirurgisk påføre kontrollert sløv og skarp ryggmargsskader på en regenererende Axolotl (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Formålet med denne studien er å etablere en standardisert og reproduserbar regenererende stump ryggmargsskade modell i Axolotl (Ambystoma mexicanum). De fleste kliniske ryggmargsskader oppstår som høy energi stump traumer, inducing kontusjon Kader. Men de fleste studier i Axolotl ryggmargen har blitt gjennomført med skarpe traumer. Derfor har denne studien som mål å produsere en mer klinisk relevant regenererende modell. På grunn av sin imponerende evne til å regenerere nesten alle vev, axolotler er mye brukt som modeller i regenererende studier og har blitt brukt mye i ryggmargsskade (SCI) studier. I denne protokollen blir axolotler anesthetized ved å være i en benzocaine løsning. Under mikroskopet er en kantete snitt laget bilateralt på et nivå bare caudal til bakbena. Fra dette snittet, er det mulig å analysere og eksponere spinous prosessene. Ved hjelp av pinsett og saks, en to-nivå laminectomy utføres, utsette ryggmargen. En tilpasset Trauma enhet bestående av en fallende stang i en sylinder er konstruert, og denne enheten brukes til å indusere en kontusjon skade på ryggmargen. Snittene blir så sutured, og dyret gjenoppretter fra anestesi. Den kirurgiske tilnærmingen er vellykket i å utsette ryggmargen. Den traumer mekanismen kan produsere kontusjon skader på ryggmargen, som bekreftes av histologi, MRI, og nevrologisk undersøkelse. Til slutt regenererer ryggmargen fra skaden. Den kritiske trinn i protokollen er å fjerne spinous prosessene uten å påføre skade på ryggmargen. Dette trinnet krever opplæring for å sikre en sikker prosedyre. Videre er sår lukking svært avhengig av ikke å påføre unødig skade på huden undersnitt. Protokollen ble utført i en randomisert studie av 12 dyr.
Introduction
Det overordnede målet med denne studien var å etablere en kontrollert og reproduserbar mikrokirurgisk metode for å påføre sløv og skarp SCI til Axolotl (Ambystoma mexicanum), produsere en regenererende ryggmargsskade modell.
Sci er en alvorlig tilstand som, avhengig av nivå og utstrekning, påfører nevrologiske funksjonshemming til ekstremiteter sammen med nedsatt blære og tarm kontroll1,2,3. De fleste sci er et resultat av høy energi Blunt traumer som trafikkulykker og faller4,5. Skarpe skader er svært sjeldne. Derfor er den vanligste makroskopisk skade typen contusions.
Den pattedyr sentrale nervesystemet (CNS) er en ikke-regenererende vev, derfor ingen restaurering av nevrologiske vev etter sci er sett6,7,8. På den annen side, noen dyr har en spennende evne til å regenerere vev, inkludert CNS vev. En av disse dyrene er Axolotl. Det er mye brukt i studier av regenererende biologi og er av interesse for ryggmargen gjenfødelse, fordi det er en virveldyr9,10,11,12.
De fleste sci studier i Axolotl utføres som enten amputasjon av hele halen eller ablasjon av en større del av ryggmargen9,10,11,12. Nylig ble en ny studie publisert på stump skader13 som etterligner kliniske situasjoner bedre. Mens komplett vedheng amputasjon i Axolotl resulterer i full regenerering, noen ikke-amputasjon-baserte regenererende fenomener er avhengig av den kritiske størrelsen defekt (CSD)14,15. Dette betyr at skader som overskrider en kritisk terskel, ikke genereres på. For å utvikle en regenererende modell med høyere klinisk translational verdi, undersøkte denne studien om en 2 mm Butt traume ville overskride CSD-grensen.
Denne metoden er relevant for forskere som arbeider på ryggmargen regenerering i små dyremodeller, spesielt i Axolotl. Videre kan det være av mer generell interesse, fordi det viser en måte å bruke standard laboratorieutstyr for å utvikle en butt traume mekanisme som er egnet for bruk i små dyr generelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordi risikoen for skade på ryggmargen er betydelig, de kritiske trinnene i protokollen er å fjerne spinous prosesser og utvidelse av bein tilgang til spinal kanalen hvis nødvendig. Som nevnt i protokollen, å fjerne den mest skallen prosessen første er sterkt anbefalt. Dette vil bety at de mer caudal prosessene beskytte ryggmargen fra å bli truffet av saksen. Det anbefales å sikre nok kirurgisk tilgang, noe som betyr å ikke gjøre for lite en primær snitt. Også, når du griper noe med pinsett, må retningen på…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, Aarhus University for sin ekspertise og tid på å utvikle MRI-protokoller og sette opp hele prosjektet. Peter Agger, Aarhus University for sin ekspertise og tid på å utvikle MRI-protokollene. Steffen Ringgard, Aarhus universitet for sin ekspertise og tid på å utvikle MRI-protokollene. Utviklingen av SCI-modellen i Axolotl var vennlig støttet av The A.P. Møller Maersk Foundation, The Riisfort Foundation, The linex Foundation, og The ELRO Foundation.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
