膀胱充填中にスブロテリウムに直接アクセスするために脱皮筋を除去した分散型(Ex Vivo)マウス膀胱モデル
Summary
デトルソールフリー膀胱モデルは、サブグロテリウムへの直接アクセスを可能にし、尿の貯蔵および空洞化中にサブロテリウム/ラミナ・プロプリアにおける生物学的に活性なメディエーターの可用性を調節するための局所メカニズムを研究する。調製物は、無傷の膀胱の充填によく似ており、全身的な影響を受けずに圧力量の研究を行うことができます。
Abstract
これまでの研究では、Ussingチャンバーに貼られた平らな膀胱粘膜シートからの化学物質の放出を確立し、静水圧または機械的ストレッチの変化、静水圧変化、ストレッチ、細胞腫脹、またはドラッグ力、および充填終了時の膀胱内腔における培養尿道細胞の変化にさらされています。このような知見は、これらのメディエーターが膀胱充填中にスグロテリウム(SubU)/ラミナプロプリア(LP)にも放出され、膀胱壁の深部の細胞に影響を与え、最終的に膀胱の興奮性を調節するという仮定につながった。このような研究には少なくとも2つの明白な制限があります:1)これらのアプローチのいずれもSubU/LPにおけるメディエーターの存在に関する直接的な情報を提供せず、2)使用される刺激は生理学的ではなく、膀胱の本物の充填を再現しません。ここでは、膀胱充填の過程で膀胱粘膜の皮下表面に直接アクセスできるようにする手順について議論する。私たちが作成したマウスのデトルッサーフリー製剤は、無傷の膀胱の充填によく似ており、脊髄反射および脱離滑筋からの混乱シグナル伝達がない場合に膀胱に対して圧力量の研究を行うことができます。新しいデトルッサーフリー膀胱モデルを用いて、我々は最近、メディエーターの静脈内測定は、膀胱充填中にSubU/LPに放出または存在したものへのプロキシとして使用できないことを実証した。このモデルは、放出され、代謝によって生成され、膀胱充填の過程でSubU/LPに輸送され、膀胱のニューロンおよび平滑筋に情報を伝達し、減衰および興奮の間にその興奮性を調節する尿黒体由来シグナル伝達分子の検査を可能にする。
Introduction
このモデルの目的は、膀胱充填の異なる段階の間に膀胱粘膜の粘膜下側への直接アクセスを可能にすることです。
膀胱は充填時の早期収縮を控え、臨界体積と圧力に達すると空にしなければならない。尿の異常な大腸または空洞化は、膀胱充填の過程でデトルッサー平滑筋(DSM)の異常な興奮性にしばしば関連する。DSMの興奮性は、平滑筋細胞に固有の因子および膀胱壁内の異なる細胞型によって生成される影響によって決定される。尿膀胱の壁は、尿肉腫(粘膜)、スグロテリウム(SubU)/ラミナプロプリア(LP)、脱石平滑筋(DSM)およびセローザからなる(図1A)。尿黒周体は、傘細胞(すなわち、尿黒体の最も外側の層)、中間細胞、および基底細胞(すなわち、尿黒体の最も内側の層)からなる。間質細胞、線維芽細胞、椎間神経末端、小血管、免疫細胞など、様々な種類の細胞がSubU/LPに存在する。膀胱尿経皮は、SubU/LPおよびDSM1、2、3の細胞に影響を与える粘膜下にメディエーターを放出することによって反射反射のミチュレーションおよび大腸を開始する感覚器官であると広く仮定される。ほとんどの場合、このような仮定はメディエーターの放出を実証した研究に基づいています:静水圧4、5の変化にさらされた粘膜の断片から。ストレッチ6、7、低トニシティ誘発細胞腫脹7またはドラッグ力8に曝露された培養尿道細胞から;受容体または神経活性化時に分離された膀胱壁ストリップから9,10,11,12,13,14;膀胱充填の末端の膀胱内腔15、16、17、18、19.このような研究は、膀胱壁セグメントまたは培養尿中細胞の機械的刺激時にメディエーターの放出を実証するのに役立ったが、膀胱充填を再現する生理的刺激によって引き起こされる粘膜下のメディエーターの放出に関する直接的な証拠によって支持される必要がある。これは、SubU/LPが膀胱の充填中にSubU/LPの近くに簡単にアクセスするのを妨げる膀胱壁の深部に位置していることを考えると、挑戦的な作業です。
ここでは、膀胱の尿経骨、DSMおよび膀胱壁の他の細胞型との間のシグナル伝達に関与するメカノトランス誘導の局所的メカニズムに関する研究を容易にするために開発されたデトルター筋肉除去13を有する分散型(ex vivo)マウス膀胱モデルを例示する。このアプローチは、膀胱内の生理学的圧力および体積に応じて放出または形成される尿黒皮由来メディエーターのSubU/LP付近での直接測定を可能にし、細胞培養における潜在的な表形の変化を回避するため、平らな膀胱壁シート、膀胱壁ストリップまたは培養尿中細胞を使用する場合に優れています。これは、膀胱充填の異なる段階でSubU/LPにおけるメディエーターの可用性、放出、代謝および経尿中輸送を測定するために使用することができる(図1B)。調製物はまた、過活動および不活発膀胱症候群のモデルにおける尿動脈シグナル伝達およびメカノトランスクションを調べるために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
膀胱には、尿の貯蔵と空隙という2つの機能があります。これらの機能の正常な動作は、消失筋の興奮性を調節するために膀胱壁の細胞を介して信号のイントラルミナスボリュームと圧力と伝達の適切な機械的センシングを必要とします。膀胱粘膜(尿黒体)は、膀胱壁の多数の細胞型に影響を与えるSubU/LP内の様々なシグナル伝達分子を放出することによって膀胱の興奮性を調節すると考えられ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所グラントDK41315によって支援されました。
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
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