Ein dezentralisiertes (Ex Vivo) Murine Blasenmodell mit dem Detrusormuskel entfernt für direkten Zugang zum Suburothelium während der Blasenfüllung
Summary
Das detrusorfreie Blasenmodell ermöglicht den direkten Zugang zum Suburothel, um lokale Mechanismen zur Regulierung der biologisch aktiven Mediatorverfügbarkeit in Suburothelium/Lamina propria während der Lagerung und Leerung von Urin zu untersuchen. Das Präparat ähnelt dem Füllen einer intakten Blase und ermöglicht Druckvolumenstudien ohne systemische Einflüsse.
Abstract
Frühere Studien haben die Freisetzung chemischer Substanzen aus flachen Blasenschleimhautplatten, die in Ussing-Kammern angebracht und Veränderungen des hydrostatischen Drucks oder der mechanischen Dehnung und von kultivierten Urothelzellen bei hydrostatischen Druckänderungen, Dehnungs-, Zellschwellungs- oder Schleppkräften und in Blasenlumen am Ende der Füllung ausgesetzt sind, festgestellt. Solche Ergebnisse führten zu der Annahme, dass diese Mediatoren auch in Suburothelium (SubU)/Lamina propria (LP) während der Blasenfüllung freigesetzt werden, wo sie Zellen tief in der Blasenwand beeinflussen, um letztendlich die Blasenerregbarkeit zu regulieren. Es gibt mindestens zwei offensichtliche Einschränkungen in solchen Studien: 1) Keiner dieser Ansätze liefert direkte Informationen über das Vorhandensein von Mediatoren in SubU/LP, und 2) die verwendeten Reize sind nicht physiologisch und rekapitulieren nicht die authentische Füllung der Blase. Hier diskutieren wir ein Verfahren, das den direkten Zugang zur suburotheliale Oberfläche der Blasenschleimhaut im Verlauf der Blasenfüllung ermöglicht. Das murine detrusorfreie Präparat, das wir erstellt haben, ähnelt der Füllung der intakten Blase und ermöglicht druckvolumende Untersuchungen an der Blase in Ermangelung verwirrender Signale durch Wirbelsäulenreflexe und Detrusor-Glattmuskel. Anhand des neuartigen detrusorfreien Blasenmodells haben wir kürzlich gezeigt, dass intravesische Messungen von Mediatoren nicht als Proxy für das verwendet werden können, was während der Blasenfüllung im SubU/LP freigesetzt oder vorhanden ist. Das Modell ermöglicht die Untersuchung von urothelium-abgeleiteten Signalmolekülen, die freigesetzt, durch Stoffwechsel erzeugt und/oder im Laufe der Blasenfüllung in den SubU/LP transportiert werden, um Informationen an Neuronen und glatten Muskel der Blase zu übertragen und ihre Erregbarkeit während der Kontinenz und Micturition zu regulieren.
Introduction
Der Zweck dieses Modells ist es, den direkten Zugang zur submukossalen Seite der Blasenschleimhaut während verschiedener Phasen der Blasenfüllung zu ermöglichen.
Die Blase muss auf eine vorzeitige Kontraktion während der Befüllung verzichten und entleeren, wenn kritisches Volumen und Druck erreicht werden. Abnormale Kontinenz oder Leerung des Urins sind häufig mit abnormaler Erregbarkeit des Detrusor glatten Muskels (DSM) im Laufe der Blasenfüllung verbunden. Die Erregbarkeit von DSM wird durch Faktoren bestimmt, die den glatten Muskelzellen innewohnen, und durch Einflüsse, die von verschiedenen Zelltypen innerhalb der Blasenwand erzeugt werden. Die Wand der Harnblase besteht aus Urothelium (Mukosa), Suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), Detrusor glatter Muskel (DSM) und Serosa (Abbildung 1A). Das Urothel besteht aus Schirmzellen (d.h. der äußersten Schicht des Urothel), Zwischenzellen und Basalzellen (d. h. der innersten Schicht des Urothel). Verschiedene Arten von Zellen, einschließlich interstitielle Zellen, Fibroblasten, affefente Nerventerminals, kleine Blutgefäße und Immunzellen befinden sich in der SubU/LP. Es wird allgemein angenommen, dass das Blasenurothel ein Sinnesorgan ist, das Reflex-Micturition und Kontinenz initiiert, indem es Mediatoren in die Submukose freisetzt, die Zellen in der SubU/ LP und im DSM1,2,3. Zum größten Teil basieren solche Annahmen auf Studien, die die Freisetzung von Mediatoren gezeigt haben: aus Schleimhautteilen, die Veränderungen des hydrostatischen Drucks ausgesetzt sind4,5; von kultivierten urotheliale Zellen, die dehnung6,7, Hypotonizität-induzierte Zellschwellung7 oder Schleppkräfteausgesetzt 8; von isolierten Blasenwandstreifen auf Rezeptor oder Nervenaktivierung9,10,11,12,13,14; und in Blase Lumen am Ende der Blasenfüllung15,16,17,18,19. Während solche Studien entscheidend waren, um die Freisetzung von Mediatoren bei mechanischer Stimulation von Blasenwandsegmenten oder kultivierten Urothelzellen zu demonstrieren, müssen sie durch direkte Beweise für die Freisetzung von Mediatoren in der Submucosa gestützt werden, die durch physiologische Reize ausgelöst werden, die die Blasenfüllung reproduzieren. Dies ist eine schwierige Aufgabe, da sich der SubU/LP tief in der Blasenwand befindet und den direkten Zugang zur Nähe von SubU/LP während der Blasenfüllung behindert.
Hier illustrieren wir ein dezentralisiertes (ex vivo) murines Blasenmodell mit dem Detrusormuskel entfernt13, das entwickelt wurde, um Studien über lokale Mechanismen der Mechanotransduktion zu erleichtern, die an der Signalisierung zwischen dem Blasenurothel, DSM und anderen Zelltypen in der Blasenwand teilnehmen. Dieser Ansatz ist der Verwendung von flachen Blasenwandblättern, Blasenwandstreifen oder kultivierten Urothelzellen überlegen, da er direkte Messungen in der Nähe von SubU/LP von Urothel-abgeleiteten Mediatoren ermöglicht, die als Reaktion auf physiologische Drücke und Volumina in der Blase freigesetzt oder gebildet werden und mögliche phänotypische Veränderungen in der Zellkultur vermeiden. Es kann verwendet werden, um Verfügbarkeit, Freisetzung, Stoffwechsel und transurotheliale Transport von Mediatoren in SubU/LP in verschiedenen Stadien der Blasenfüllung zu messen (Abbildung 1B). Das Präparat kann auch verwendet werden, um urotheliale Signalisierung und Mechanotransduktion in Modellen von überaktiven und unteraktiven Blasensyndromen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Blase hat zwei Funktionen: Lagerung und Leerung von Urin. Der normale Betrieb dieser Funktionen erfordert eine ordnungsgemäße mechanische Erfassung des intraluminalen Volumens und des Drucks sowie die Transduktion von Signalen durch Zellen in der Blasenwand, um die Erregbarkeit der Detrusormuskulatur zu regulieren. Die Blasenschleimhaut (Urothelium) wird geglaubt, um Blasenerregbarkeit zu regulieren, indem eine Vielzahl von Signalmolekülen in der SubU/LP freigesetzt wird, die zahlreiche Zelltypen in der Blasenwand…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant DK41315 unterstützt.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
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