Изоляция региона конкретных микроглии от одного взрослого полушария мозга мыши для глубокой одноклеточной РНК секвенирования
Summary
Мы предоставляем протокол для изоляции микроглии от различных расчлененных областей полушария мозга взрослой мыши, а затем полуавтоматизированную подготовку библиотеки для глубокого одноклеточного секвенирования РНК полнометражных транскриптомов. Этот метод поможет выяснить функциональную неоднородность микроглии в здоровье и болезни.
Abstract
Как резидент макрофаги в центральной нервной системе, микроглии активно контролируют развитие мозга и гомеостаза, и их дисфункции могут управлять человеческими заболеваниями. Значительные успехи были сделаны, чтобы раскрыть молекулярные подписи гомеостатической микроглии, а также изменения их экспрессии генов в ответ на экологические стимулы. С появлением и созреванием одноклеточных геномных методологий все шире признается, что неоднородная микроглия может лежать в основе различных ролей, которые они играют в различных условиях развития и патологических условиях. Дальнейшее вскрытие такой неоднородности может быть достигнуто путем эффективной изоляции микроглии от данной области интереса, за которой следует чувствительное профилирование отдельных клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для быстрой изоляции микроглии из различных областей мозга в одном полушарии мозга для взрослых мышей. Мы также демонстрируем, как использовать эти отсортированные микроглии для одноклеточного секвенирования РНК на основе пластин. Мы обсуждаем приспособляемость этого метода к другим сценариям и предоставляем руководящие принципы для совершенствования системы для размещения крупномасштабных исследований.
Introduction
Микроглия, представляющая 5%-10% всех нервных клеток, являются резидентными макрофагами, разбросанными по всей центральной нервной системе (ЦНС)1. Защищенный за гематоэнцефалии барьер, типичные микроглии в здоровом мозге взрослого содержат много тонких процессов, которые быстро продлить и втягивать взаимодействовать с нейронами и другими глиальными клетками в parenchyma. Микроглия может также принять амебоидной морфологии, связанные с увеличением фагоцитарной функции на конкретных стадиях развития или на иммунные проблемы при травме и болезни1,2,3,4. Недавние захватывающие открытия ясно показали, что микроглии ни в коем случае не являются пассивными наблюдателями к мозгу полученных или патологических сигналов, но играют ключевую роль в контроле развития мозга и гомеостаза, например, поддерживая выживание нейронов, обрезка незрелых синапсов, содействие дифференциации линий олигодендроцитов, а также ангиогенез1. По мере того как больше функций микроглии выяснены, возбуждение более далее подпитывается людскими исследованиями генетики, которые показали что много нейродегенеративных генов риска заболевания, such as TREM2, большей частью или исключительн выражено микроглией5,6,7. . Учитывая их значение в развитии и правдоподобные болезни вождения роли, огромные усилия были направлены на наше понимание микроглиальной регуляции генов и функции в надежде найти новые терапевтические цели для нейродегенеративных заболеваний1,8.
Секвенирование РНК (РНК-сек) позволяет объективно охарактеризовать экспрессию генов типа клеток, что, в свою очередь, направляет ученых к изучению функций генов в плотных клеточных сетях7. РНК-сек в основном было сделано на массовых образцов, что привело к открытию гомеостатической микроглиальной подписи гена, который отличает их от других нервных и иммунных клеток9. Однако такой подход может упускать из виду молекулярные и функциональные различия между микроглией, особенно те, которые временно присутствуют в процессе развития, или связанные со старением и болезнями. Действительно, одноклеточный РНК-сек (scRNA-seq) предлагает чувствительность и разрешение, которые произвели революцию в этой области, выявив ранее недооцененную неоднородность микроглии в различных контекстах2,3,10. Кроме того, в связи с наличием других аналогичных иммунных клеток на цНС-циркуляции интерфейса, scRNA-seq предоставляет информацию, помогающую дизайн новых инструментов для разделения и функционально вскрыть эти связанные клетки с небольшим ипредварительных знаний2,11.
Был изобретен разнообразный набор платформ scRNA-seq, каждая из которых подходит для определенных приложений12. В целом, методы на основе капель, такие как 10x геномика, выше пропускной связи с (десятки) тысячи клеток последовательной в каждом запуске, и они менее избирательны для ввода, которые могут содержать смешанные популяции клеток, требующих широкой классификации. Методы на основе плит обеспечивают более высокую чувствительность и глубину чтения13,14, как правило, ориентации конкретных популяций от сортировки клеток, чтобы выявить тонкие различия или редкие стенограммы. Учитывая небольшой процент микроглиальных клеток, особенно субпопуляций, связанных с развитием или болезнями, среди всех типов клеток ЦНС, часто желательно изолировать микроглию от конкретной области, интересуемых, и получить глубокую и полноформатную транскриптомическую информацию, с тем чтобы понять их неоднородность.
Здесь мы предоставляем подробную информацию о том, как изолировать микроглии из различных областей мозга мыши расчленены из одного полушария, которые используются для одноклеточных (или объемных) РНК-сек после полуавтоматической пластины на основе процедуры подготовки библиотеки. Другое полушарие может быть использовано для гистологической проверки. Оптимизированный из ранее опубликованного метода9,этот протокол изоляции направлен на максимизацию выхода от небольшого количества исходных материалов, а тем временем поддерживать эндогенные профили экспрессии микроглиальных генов. Мы используем флуоресценцию активированных клеток сортировки (FACS) для обогащения микроглии (или других связанных иммунных клеток, представляющих интерес) в 96-колодных пластин и миниатюризации объемов реагентов для подготовки библиотеки для того, чтобы увеличить пропускную способность. Мы выделяем эту чувствительную платформу scRNA-seq, хотя могут быть применены и другие стратегии на основе пластин. Этот метод может быть легко адаптирован для изоляции микроглии от других расчлененных тканей, таких как травмы или заболевания очагов, и возраст мыши может варьироваться практически на всех послеродовых стадиях. Эффективная изоляция региональной микроглии для одноклеточных исследований транскриптомики будет способствовать лучшему пониманию их функций в области здравоохранения и болезней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроглия активно взаимодействует с другими типами клеток в ЦНС, и они очень чувствительны к экологическим стимулам. Для того, чтобы свести к минимуму воспалительные реакции и аномальные изменения в экспрессии их генов в процессе изоляции, этот протокол был упорядочен из ранее опублик…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Марико Л. Беннетт, Лиану Николь Бонанно и Спироса Дарманиса за помощь в разработке этого протокола. Мы также благодарим Стэнфордский общий фонд FACS, в частности Мередит Вегларц и Лиза Николс; Иен Тран, Майкл Экарт из Стэнфордского протеина и нуклеиновой кислоты фонда (PAN) за их большую поддержку для съемок. Эта работа финансируется Фондом JPB и Фондом Винсента Коутса.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
