Isolering af region-specifikke mikroglia fra en voksen mus hjerne halvkugle for dyb single-celle RNA Sequencing
Summary
Vi leverer en protokol til isolering af microglia fra forskellige dissekted regioner af en voksen mus hjerne halvkugle, efterfulgt af semi-automatiseret bibliotek forberedelse til dyb single-celle RNA sekvensering af fuld længde transkriptomer. Denne metode vil bidrage til at belyse funktionelle heterogenitet mikroglia i sundhed og sygdom.
Abstract
Som hjemmehørende makrofager i centralnervesystemet, microglia aktivt kontrollere hjernens udvikling og homøostase, og deres dysfunktioner kan drive sygdomme hos mennesker. Der er gjort betydelige fremskridt for at afdække de molekylære signaturer af homeostatisk mikroglia samt ændringer af deres genekspression som reaktion på miljømæssige stimuli. Med fremkomsten og modning af enkelt-celle genomiske metoder, er det i stigende grad erkendes, at heterogene mikroglia kan ligge til grund for de forskellige roller, de spiller i forskellige udviklingsmæssige og patologiske forhold. Yderligere dissektion af sådanne heterogenitet kan opnås ved effektiv isolering af mikroglia fra en given region af interesse, efterfulgt af følsom profilering af individuelle celler. Her giver vi en detaljeret protokol til hurtig isolering af microglia fra forskellige hjerneområder i en enkelt voksen mus hjerne halvkugle. Vi demonstrerer også, hvordan man bruger disse sorterede mikroglia til plade baseret dyb enkelt celle-RNA-sekvensering. Vi diskuterer tilpasningsevnen af denne metode til andre scenarier og giver retningslinjer for at forbedre systemet til at rumme store undersøgelser.
Introduction
Microglia, der repræsenterer 5% − 10% af alle neurale celler, er residente makrofager spredt over hele centralnervesystemet (CNS)1. Beskyttet bag blod-hjerne barrieren, typisk microglia i en sund voksen hjerne indeholder mange fine processer, der hurtigt udvide og trække sig tilbage for at interagere med neuroner og andre gliale celler i parentchyma. Microglia kan også vedtage amoeboid morfologi forbundet med øget Fagocytisk funktion i specifikke udviklingsmæssige stadier eller på immun udfordringer i skade og sygdom1,2,3,4. Nylige spændende opdagelser har klart vist, at microglia er på ingen måde passive tilskuere til hjerne-afledte eller patologiske signaler, men spiller centrale roller i at kontrollere hjernens udvikling og homøostase, for eksempel ved at støtte neuronal overlevelse, beskæring umodne synapser, fremme oligodendrocyte Lineage celler differentiering samt angiogenese1. Som flere funktioner i microglia er belyst, spændingen er yderligere næret af humangenetik undersøgelser, som viste, at mange neurodegenerative sygdomme risiko gener, såsom TREM2, overvejende eller udelukkende udtrykkes ved microglia5,6,7. I betragtning af deres betydning i udvikling og plausible sygdom-kørsel roller, enorm indsats er for nylig blevet sat i retning af vores forståelse af mikroglial gen regulering og funktion i håb om at finde nye terapeutiske mål for Neurodegenerative sygdomme 1,8.
RNA-sekvensering (RNA-SEQ) giver mulighed for objektiv karakterisering af celletype-specifik genekspression, som igen guider forskerne til at undersøge genfunktioner i tætte cellulære netværk7. RNA-SEQ var for det meste udført på bulkprøver, hvilket førte til opdagelsen af en homeostatisk mikroglial gensignatur, der adskiller dem fra andre neurale og immunceller9. Men, en sådan tilgang kunne overse molekylære og funktionelle forskelle mellem microglia, især dem, der forbigående i udvikling, eller forbundet med aldring og sygdom. Enkelt celle-RNA (scrna-SEQ) tilbyder den følsomhed og opløsning, der har revolutioneret feltet ved at afsløre tidligere undervurderet heterogenitet af microglia i en række forskellige sammenhænge2,3,10. På grund af tilstedeværelsen af andre lignende immunceller i CNS-cirkulations interfacet giver scRNA-SEQ oplysninger, der er med til at designe nye værktøjer til at adskille og funktionelt dissekere disse relaterede celler med lidt forudgående viden2,11.
En bred vifte af scRNA-SEQ platforme er blevet opfundet, hver egnet til visse anvendelser12. Generelt, dråbe baserede metoder, såsom 10x Genomics, er højere i gennemløb med (titusinder) af celler sekvenserede i hvert løb, og de er mindre selektive for input, som kan indeholde blandede cellepopulationer, der kræver bred kategorisering. Plade baserede metoder giver højere følsomhed og læse dybde13,14, som regel rettet mod bestemte populationer fra celle sortering for at afsløre subtile forskelle eller sjældne udskrifter. I betragtning af den lille procentdel af mikrogliale celler, især de udviklings-eller sygdomsrelaterede delpopulationer, blandt alle CNS-celletyper, er det ofte ønskeligt at isolere mikroglia fra en bestemt region af interesse og opnå dybe og fuld længde transkriptomic oplysninger for at forstå deres heterogenitet.
Her giver vi oplysninger om, hvordan man isolerer mikroglia fra forskellige mus-hjerneområder, der er dissekeret fra en enkelt halvkugle, som bruges til enkelt celle-RNA-SEQ efter en halvautomatiseret plade baseret forberedelsesprocedure. Den anden halvkugle kan derefter anvendes til histologisk validering. Strømlinet fra en tidligere offentliggjort metode9, denne isolation protokol har til formål at maksimere udbyttet fra små mængde af råvarer, og i mellemtiden opretholde endogene microglial Gen ekspression profiler. Vi bruger fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) til at berige microglia (eller andre relaterede immunceller af interesse) i 96-brønd plader og miniaturize mængderne af reagenser til Biblioteks forberedelse for at øge gennemløb. Vi fremhæver denne følsomme scRNA-SEQ-platform, selv om der kan anvendes andre plade baserede strategier. Denne metode kan let tilpasses til at isolere mikroglia fra andre dissekeret væv, såsom skade eller sygdom Foci, og alder af musen kan variere på tværs af næsten alle postnatale stadier. En effektiv isolering af det regionale mikroglia til undersøgelser af enkelt cellet transkriptomik vil gøre det lettere at forstå deres funktioner inden for sundhed og sygdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia interagerer aktivt med andre celletyper i CNS, og de er meget følsomme over for miljømæssige stimuli. For at minimere inflammatoriske reaktioner og afvigende ændringer i deres genekspression under isolations processen, er denne protokol blevet strømlinet fra en tidligere offentliggjort metode9, og det er nu egnet til at isolere microglia fra flere regioner af en enkelt mus hjerne halvkugle parallelt. Væv og reagenser holdes ved kold temperatur, og eksperimenter udføres rettidigt (…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno og Spyros Darmanis for deres hjælp under udviklingen af denne protokol. Vi takker også Stanford Shared FACS-faciliteten, især Meredith Weglarz og Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart fra Stanford protein og Nucleic Acid facilitet (PAN) for deres store støtte til optagelserne. Dette arbejde finansieres af JPB Foundation og Vincent J. Coates Foundation.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
