Isolering av regionspecifika Microglia från en vuxen mus hjärnhalva halvklotet för djup Single-cell RNA sekvensering
Summary
Vi tillhandahåller ett protokoll för isolering av mikroglia från olika dissekerade regioner i en vuxen mus hjärnhalva, följt av semi-automatiserad bibliotek förberedelse för djup Single-cell RNA sekvensering av fullängds transcriptomes. Denna metod kommer att bidra till att belysa funktionella heterogenitet av mikroglia i hälsa och sjukdom.
Abstract
Som bosatt makrofager i centralanervsystemet, mikroglia aktivt kontrollera hjärnans utveckling och homeostas, och deras dysfunktioner kan driva mänskliga sjukdomar. Avsevärda framsteg har gjorts för att avslöja de molekylära signaturerna för homeostatiska mikroglia samt förändringar av deras genuttryck som svar på miljömässiga stimuli. Med tillkomsten och mogningen av encelliga genomiska metoder, är det alltmer erkänt att heterogena mikroglia kan ligga till grund för de olika roller de spelar i olika utvecklings-och sjukdomstillstånd. Ytterligare dissektion av sådan heterogenitet kan uppnås genom effektiv isolering av mikroglia från en given region av intresse, följt av känslig profilering av enskilda celler. Här ger vi ett detaljerat protokoll för snabb isolering av mikroglia från olika hjärnregioner i en enda vuxen mus hjärnhalva. Vi visar också hur man använder dessa sorterade mikroglia för plattbaserade djupa encellig RNA-sekvensering. Vi diskuterar anpassbarhet av denna metod till andra scenarier och ge riktlinjer för att förbättra systemet för att rymma storskaliga studier.
Introduction
Microglia, som representerar 5% − 10% av alla neurala celler, är bosatta makrofager spridda över hela centralanervsystemet (CNS)1. Skyddad bakom blod-hjärnbarriären, typiska mikroglia i en frisk vuxen hjärna innehåller många fina processer som snabbt utvidga och dra tillbaka för att interagera med nervceller och andra gliaceller i parenkymet. Microglia kan också anta Amoeboid morfologi i samband med ökad fagocytos funktion under specifika utvecklingsstadier eller på immun utmaningar i skada och sjukdom1,2,3,4. Senaste spännande upptäckter har tydligt visat att mikroglia är ingalunda passiva åskådare till hjärnan-derived eller patologiska signaler, men spelar centrala roller i att kontrollera hjärnans utveckling och homeostas, till exempel genom att stödja neuronala överlevnad, beskärning omogna synapser, främja oligodendrocyte härstamning celler differentiering samt angiogenes1. Eftersom fler funktioner av mikroglia är klarlagda, är spänningen ytterligare drivet av humangenetik studier, som visade att många neurodegenerativa sjukdomar riskgener, såsom TREM2, huvudsakligen eller uteslutande uttrycks av mikroglia5,6,7. Med tanke på deras betydelse i utvecklingen och sannolika sjukdoms drivande roller, har enorma ansträngningar nyligen satts mot vår förståelse av mikrogliala genreglering och funktion i hopp om att hitta nya terapeutiska mål för neurodegenerativa sjukdomar1,8.
RNA-sekvensering (RNA-SEQ) möjliggör en opartisk karakterisering av celltypspecifika genuttryck, som i sin tur vägleder forskarna att undersöka gen funktioner i täta cellulära nätverk7. RNA-SEQ hade mestadels gjorts på bulkprover, vilket ledde till upptäckten av en homeostatisk mikroglial gensignatur som skiljer dem från andra neurala och immunceller9. En sådan strategi kan dock förbise molekylära och funktionella skillnader mellan mikroglia, särskilt de som transitivt förekommer i utvecklingen, eller i samband med åldrande och sjukdom. I själva verket erbjuder Single-cell RNA-SEQ (scrna-SEQ) den känslighet och upplösning som har revolutionerat området genom att avslöja tidigare underskattade heterogenitet av mikroglia i en mängd olika sammanhang2,3,10. Dessutom, på grund av närvaron av andra liknande immunceller vid CNS-cirkulation gränssnitt, scRNA-SEQ ger information hjälpa utformningen av nya verktyg för att separera och funktionellt dissekera dessa relaterade celler med lite tidigare kunskap2,11.
Ett varierat utbud av scRNA-SEQ plattformar har uppfunnits, var och en lämplig för vissa tillämpningar12. I allmänhet är droplet-baserade metoder, till exempel 10X genomik, högre i dataflödet med (tiotals) tusentals celler sekvenserade i varje körning och de är mindre selektiva för indata som kan innehålla blandade cellpopulationer som kräver bred kategorisering. Plattbaserade metoder ger högre känslighet och Läs djup13,14, som vanligtvis riktar sig till specifika populationer från cell sortering för att avslöja subtila skillnader eller sällsynta utskrifter. Med tanke på den lilla andelen mikrogliala celler, särskilt de utvecklings-eller sjukdomsassocierade subpopulationer, bland alla CNS-celltyper, är det ofta önskvärt att isolera mikroglia från en specifik region av intresse och få djupgående och fullängds transcriptomic information för att förstå deras heterogenitet.
Här ger vi information om hur man isolerar mikroglia från olika mus hjärnregioner dissekeras från en enda halvklotet, som används för Single-cell (eller bulk) RNA-SEQ efter en semi-automatiserad plattbaserade bibliotek förberedelse förfarande. Den andra halvklotet kan sedan användas för histologisk validering. Detta isolerings protokoll effektiviseras från en tidigare publicerad metod9och syftar till att maximera avkastningen från små mängder utgångsmaterial, och samtidigt bibehålla endogena mikrogliala genuttrycksprofiler. Vi använder fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) för att berika mikroglia (eller andra relaterade immunceller av intresse) i 96-well plattor och miniatyrisera volymerna av reagenser för biblioteks beredning för att öka genomströmningen. Vi lyfter fram denna känsliga plattform för scRNA-SEQ, även om andra plattbaserade strategier kan tillämpas. Denna metod kan lätt anpassas för att isolera mikroglia från andra dissekerade vävnader, såsom skada eller sjukdom Foci, och ålder av musen kan variera över nästan alla postnatal stadier. Effektiv isolering av regionala mikroglia för encellig transkriptomik studier kommer att underlätta bättre förståelse för deras funktioner i hälsa och sjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia interagerar aktivt med andra celltyper i CNS, och de är mycket känsliga för miljömässiga stimuli. För att minimera inflammatoriska reaktioner och avvikande förändringar i deras genuttryck under isolerings processen, har detta protokoll effektiviserats från en tidigare publicerad metod9, och det är nu lämpligt att isolera mikroglia från flera regioner i en enda mus hjärnhalva i parallella. Vävnaderna och reagenser hålls vid kall temperatur och experiment utförs i tid (ca 3…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno, och Spyros Darmanis för deras hjälp under utvecklingen av detta protokoll. Vi tackar också Stanford Shared FACS-anläggningen, särskilt Meredith Weglarz och Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart från Stanford protein och nukleinsyra Facility (PAN) för deras stora stöd för inspelningen. Detta arbete finansieras av JPB Foundation och Vincent J. Coates Foundation.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
