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Article de méthode

Greffe tissulaire pour la reconstruction oesophagielle circonférence chez les rats

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DOI :

10.3791/60349

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10 février 2020

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Dans cet article

Résumé

La reconstruction oesophagienne est une procédure difficile, et le développement d’un oesophage tissulaire qui permet la régénération de la muqueuse et du muscle oesophagiens et qui peut être implanté comme une greffe artificielle est nécessaire. Ici, nous présentons notre protocole pour générer un oesophage artificiel, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteurs, et diverses techniques chirurgicales.

Résumé

L’utilisation de matériaux biocompatibles pour la reconstruction oesophagienne circonférence est une tâche techniquement difficile chez les rats et nécessite une technique d’implant optimale avec un soutien nutritionnel. Récemment, il y a eu beaucoup de tentatives à l’ingénierie oesophagielle de tissu, mais le taux de succès a été limité en raison de la difficulté dans l’épithélisation tôt dans l’environnement spécial du péristaltisme. Ici, nous avons développé un oesophage artificiel qui peut améliorer la régénération de la muqueuse oesophagienne et des couches musculaires à travers un échafaudage tubulaire à deux couches, un système de bioréacteur à base de cellules souches mésenchymales, et une technique d’alimentation de dérivation avec modifié Gastrostomy. L’échafaudage est fait de nanofibres de polyuréthane (PU) en forme cylindrique avec un brin de polycaprolactone imprimé en trois dimensions (3D) enroulé autour de la paroi extérieure. Avant la transplantation, les cellules souches mésenchymales d’origine humaine ont été ensemiées dans le lumen de l’échafaudage, et la culture de bioréacteur a été exécutée pour augmenter la réactivité cellulaire. Nous avons amélioré le taux de survie de greffe en appliquant l’anastomose chirurgicale et couvrant la prothèse implantée avec un aileron de glande thyroïde, suivi de l’alimentation nonorale temporaire de gastrostomy. Ces greffes ont pu récapituler les résultats de l’épithélialization initial et de la régénération de muscle autour des emplacements implantés, comme démontré par l’analyse histologique. En outre, des fibres d’élastine accrues et la néovascularisation ont été observées dans la périphérie de la greffe. Par conséquent, ce modèle présente une nouvelle technique potentielle pour la reconstruction oesophagielle cirférent.

Introduction

Le traitement des désordres oesophagiens, tels que les malformations congénitales et les carcinomes oesophagiens, peut mener à la perte structurale de segment de l’oesophage. Dans la plupart des cas, des greffes de remplacement autologues, telles que des conduits gastriques ou des interpositions du côlon, ont été effectuées1,2. Cependant, ces remplacements oesophagiens ont une variété de complications chirurgicales et de risques de réopération3. Ainsi, l’utilisation d’échafaudages d’œsophage tissulaires imitant l’œsophage indigène peut être une stratégie alternative prometteuse pour fin....

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC no 17-0164-S1A0) de l’Hôpital universitaire national de Séoul.

1. Fabrication d’échafaudages

REMARQUE : Les échafaudages oesophagiens à deux couches sont fabriqués en combinant l’électrospinning et l’impression 3D. La membrane interne de l’échafaudage tubulaire a été fabriquée par le polyuréthane électrospinning (PU) avec des mandrels en acier inoxydable rotatifs comme les collecteurs9.

  1. Pour la préparation des nanofibres tubulaires PU, préparer une solutio....

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Résultats

La figure 1 montre un diagramme schématique du processus de fabrication de l’échafaudage tubulaire à deux couches PU-PCL. La solution PU a été électrospun à partir d’une aiguille de 18 G pour faire une structure interne cylindrique d’une épaisseur de 200 m. Ensuite, le PCL fondu a été imprimé sur la paroi extérieure de la nanofibre PU à intervalles réguliers. La morphologie de surface des parois intérieures et extérieures de l’échafaudage tubulaire terminé pe.......

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Discussion

Les études animales existantes sur l’oesophagi artificiel sont encore limitées par plusieurs facteurs critiques. L’échafaudage oesophagique artificiel idéal doit être biocompatible et avoir d’excellentes propriétés physiques. Il devrait pouvoir régénérer l’épithélium muqueux dans la période postopératoire tôt pour empêcher la fuite anastomotique. La régénération des couches musculaires longitudinales circulaires et externes est également importante pour le péristaltisme fonctionnel12,

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Déclarations de divulgation

Le système de bioréacteur conçu pour cette étude a été commercialisé (numéro de modèle : ACBF-100).

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le Projet de recherche et développement des technologies de la santé de la Corée par l’intermédiaire du Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), financé par le Ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (numéro de subvention : HI16C0362) et Basic Science Research Programme par l’intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l’éducation (2017R1C1B2011132). Les biospécimens et les données utilisées dans cette étude ont été fournis par la Biobank of Seoul National University Hospital, membre du Korea Biobank Network.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cage métaboliqueTEUNGDO BIO & PLANTEJD-C-66
Zoletil (dose de 50 mg/g)Virbac1000000188
0,25 % Trypsine-EDTAGibco25200-056
1 mL SeringueBD309659
2 % chlorhydrate de xylazine (Rumpun)ByelyQ-0615-035
4 % paraformaldéhydeBIOSOLUTIONBP031
4-0 VicrylETHICONW9443
9-0 VicrylETHICONW2813
Antibiotique gentamicine (septopale).Septopal0409-1207-03
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma5470
Tampon de citrate, ph6.0, 10XSigmaC9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KITVECTORSK4100
DesminSanta Cruzsc-23879
Kit de coloration élastiqueScyTeKETS-1
EthanolMerck100983
ÉthanolMerck64-17-5
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco16000-044
GlutaraldéhydeSigma354400
Anticorps IgG (H+L) Secondaire anti-souris ChèvreThermoFisherA-11001
Coiffe héparineHyupsung MedicalHS-T-05
hMSC (STEMPRO) / milieu de croissance
(MesenPRO RSTM)
InvitrogenR7788-110
Kit conjugué à la peroxydase de raifort (Vectastain)VECTORPK7800
Peroxyde d’hydrogèneJUNSEI7722-84-1
Keratin13NovusNBP1-97797
LIVE/DEAD Kit de dosage de viabilitéSondes moléculairesL3224
MatrigelCorning354262
N,N-diméthylformamide (DMF)Sigma227056
Plaques de culture tissulaire non adhérentes
à 24 puits.
Corning3738
OsO4SigmaO5500
Boîte de PétriEppendorf3072115
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010-023
Saline tamponnée au phosphate (PBS), 10XBIOSOLUTIONBP007a
Polycaprolactone (PCL) polymèreSigma440744
Polymère de polyuréthane (PU+A2 :A24)Lubrizol2363-80AE
AlimentationNanoNCHV100
ProLong Gold réactif anti-décoloration avec DAPIInvitrogenP36931
RumpunBayerQ-0615-035
Tube en T en siliconeSewoon Medical2206-005
Pommade oculaire à la terramycinePfizer Pharmaceutical KoreaW01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)Virbac LaboratoriesQ-0042-058
Kit de coloration trichromeScyTeKTRM-1
von Willebrand Factor (vWF)Santa Cruzsc 14014

Références

  1. Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
  2. Flanagan, J. C., et al.

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Réimpressions et autorisations

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