Реконструкция пищевода является сложной процедурой, и развитие тканевого пищевода, который позволяет регенерации слизистой оболочки пищевода и мышц, и которые могут быть имплантированы в качестве искусственного трансплантата необходимо. Здесь мы представляем наш протокол для создания искусственного пищевода, в ключая производство эшафота, выращивание биореакторов и различные хирургические методы.
Использование биосовместимых материалов для окружной реконструкции пищевода является технически сложной задачей у крыс и требует оптимальной техники имплантата с питательной поддержкой. В последнее время было много попыток в пищеводной ткани инженерии, но успех был ограничен из-за трудностей в ранней эпителизации в специальной среде перистальты. Здесь мы разработали искусственный пищевод, который может улучшить регенерацию слизистой оболочки пищевода и мышечных слоев через двухслойную трубчатую эшафот, мезенхимальную систему биореактора на основе стволовых клеток и метод шунтирования с модифицированным гастростомия. Эшафот изготовлен из нановолокна полиуретана (ПУ) в цилиндрической форме с трехмерной (3D) печатной нитью поликапролактона, обернутой вокруг внешней стены. До трансплантации, человеческие стволовые клетки мезенхимальных были посеяны в просвет эшафот, и биореактор выращивания было выполнено для повышения клеточной реактивности. Мы улучшили выживаемость трансплантата, применив хирургический анастомоз и покрыв имплантированный протез лоскутом щитовидной железы, за которым последовало временное кормление от неоррорной гастростомии. Эти трансплантаты смогли резюмировать результаты первоначальной эпителиализации и регенерации мышц вокруг имплантированных участков, о чем свидетельствует гистологический анализ. Кроме того, на периферии трансплантата наблюдались повышенные эластинные волокна и неоваскуляризация. Таким образом, эта модель представляет собой потенциальную новую технику для окружной реконструкции пищевода.
Лечение заболеваний пищевода, таких как врожденные пороки развития и карциномы пищевода, может привести к потере структурного сегмента пищевода. В большинстве случаев, аутологичные замены трансплантатов, таких как желудочного подтягивания каналов или толстой кишки межпозиций, были выполнены1,2. Тем не менее, эти эндофагеальные замены имеют различные хирургические осложнения и риски повторной операции3. Таким образом, использование тканевых эшафот пищевода имитируя родной пищевод может быть перспективной альтернативной стратегией для в конечном итоге регенерации потерянных тканей4,5,6.
Хотя ткань-инженерный пищевод потенциально предлагает алтернативу к в настоящее время обработка дефектов пищевода, будут значительно барьеры для своего применения in vivo. Послеоперационная анастомотическая утечка и некроз имплантированных эшафот пищевода неизбежно приводят к смертельной инфекции окружающего асептического пространства, такого как средостений7. Поэтому крайне важно предотвратить пищевые или слюнные загрязнения раны и назогастральной трубки. Гастрономия или внутривенное питание следует рассматривать до тех пор, пока первичное заживление раны не будет завершено. На сегодняшний день, пищеводных тканей инженерии была выполнена в крупных животных моделей, потому что крупные животные могут питаться только путем внутривенной гипералименции в течение 2-4 недель после имплантации эшафота8. Однако такая модель неорального кормления не была создана для раннего выживания после пересадки пищевода у мелких животных. Это потому, что животные были чрезвычайно активны и неконтролируемы, поэтому они не могли держать кормления трубки в желудке в течение длительного периода времени. По этой причине было несколько случаев успешной трансплантации пищевода у мелких животных.
С учетом обстоятельств инженерии тканей пищевода мы спроектировали двухслойную трубчатую эшафот, состоящую из электрострунна нановолокна (внутренний слой; Рисунок 1А) и прядь 3D-печати (внешний слой; Рисунок 1B) включая модифицированную методику гастростомии. Внутреннее нановолокно изготовлено из ПУ, неразлагаемого полимера, и предотвращает утечку пищи и слюны. Внешние 3D печатные нити изготовлены из биоразлагаемого поликапролактона (PCL), который может обеспечить механическую гибкость и адаптироваться к перистальтическим движениям. Человеческие жировые стволовые клетки (hAD-MSCs) были посеяны на внутреннем слое эшафота для содействия реэпителизации. Структура нановолокна может облегчить начальную регенерацию слизистой оболочки, обеспечивая структурную внеклеточную матрицу (ECM) среду для миграции клеток.
Мы также увеличили выживаемость и биоактивность привитых клеток за счет выращивания биореакторов. Имплантированная эшафот была покрыта щитовидной железой лоскут для обеспечения более стабильной регенерации слизистой оболочки пищевода и мышечного слоя. В этом отчете мы описываем протоколы для методов инженерии тканей пищевода, включая изготовление эшафотов, мезенхимальные стволовые клетки на основе биореактора, метод питания шунтирования с модифицированной гастростомией, и модифицированный хирургический анастомоз техники для окружной реконструкции пищевода в крысиной модели.
Существующие исследования на животных искусственных эзофаги по-прежнему ограничены несколькими критическими факторами. Идеальная искусственная эшафот пищевода должна быть биосовместимой и иметь отличные физические свойства. Он должен быть в состоянии регенерировать слизистой эпи?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Корейским проектом по исследованиям и разработкам технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемый Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (номер гранта: HI16C0362) и фундаментальные научные исследования Программа через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемая Министерством образования (2017R1C1B2011132). Биоспеционы и данные, использованные в этом исследовании, были предоставлены Биобанком Сеульской национальной университетской больницы, членом Корейской сети биобанков.
Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
1 mL Syringe | BD | 309659 | |
2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
Matrigel | Corning | 354262 | |
N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
OsO4 | Sigma | O5500 | |
Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
Power Supply | NanoNC | HV100 | |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |