Purkinje Cell Survival i Organotypic lillehjernen Slice kulturer
Summary
Organotypic skive kulturer er et kraftig verktøy for å studere neurodevelopmental eller degenerative/regenererende prosesser. Her beskriver vi en protokoll som modeller den neurodevelopmental død Purkinje celler i mus lillehjernen skive kulturer. Denne metoden kan ha nytte forskning i nervecellene narkotika funn.
Abstract
Organotypic Slice-kultur er en kraftig in vitro-modell som mimicks in vivo-tilstander tettere enn dissosiert primær cellekulturer. I tidlig postnatal utvikling, lillehjernen Purkinje celler er kjent for å gå gjennom en sårbar periode, der de gjennomgår programmert celle død. Her gir vi en detaljert protokoll for å utføre musen organotypic lillehjernen Slice kultur i denne kritiske tiden. Skivene er videre merket for å vurdere Purkinje celle overlevelse og effekten av nervecellene behandlinger. Denne metoden kan være svært verdifull for skjermen for nye neuroactive molekyler.
Introduction
In vitro modellering er et viktig verktøy i biomedisinsk forskning. Det gjør at etterforskerne å studere og tett kontroll spesifikke mekanismer i begrensede celletyper, eller i isolerte systemer/organer. Organotypic Slice kultur er en mye brukt in vitro teknikk, spesielt innen nevrovitenskap1. Metoden ble først etablert av Gähwiler, som kultivert hjerne skiver ved hjelp av valsen tube teknikk2, og senere endret av Yamamoto et al., som introduserte bruk av en mikroporøse membran for å utføre kortikale Slice kulturer3. Sammenlignet med primær cellekulturer, organotypic skjære kulturer presentere fordelen av å bevare cytoarchitecture av vevet, samt native celle-celle-tilkoblinger i planet av vevet delen.
Organotypic skiver har blitt kultivert fra mange deler av det sentrale nervesystemet, slik som hippocampus4, cortex5, striatum6, lillehjernen4,7og ryggmarg8,9, blant andre. De har vist seg å være et kraftig verktøy i stoffet funnet studier10. Virkningene av neuroactive molekyler kan vurderes på mange måter: overlevelse og neurodegeneration ved hjelp av immunostaining og biokjemi analyser, neuronal krets formasjon, eller forstyrrelse ved hjelp av elektrofysiologi og live-Imaging.
Målet med dette arbeidet er å beskrive en enkel metode for å utføre organotypic lillehjernen skive kultur, som er kjent for å være en relevant modell for å etterligne lillehjernen utvikling in vitro. Spesielt fokuserte vi på studiet av Purkinje celle utviklings død. In vivo, Purkinje celler gjennomgår apoptose i løpet av den første postnatal uken, med topp på postnatal dag 3 (P3)11. Det samme mønsteret er observert i lillehjernen Slice kultur, med Purkinje neurons døende av apoptose når cerebella er Hentet fra dyr mellom P1 og P8, med en topp på P34,12. Bruken av organotypic lillehjernen skive kulturer har lov til å identifisere flere nervecellene molekyler7,13, samt forstå en del av mekanismene som er involvert i denne programmerte cellen død14,15,16. Her beskriver vi en protokoll basert på studiet av Stoppini et al.17 i hippocampus, og tilpasset lillehjernen av Dusart et al.4 den inkluderer Rapid disseksjon og hakking av postnatal cerebella; kutting kultur på en cellekultur innsats som inneholder en mikroporøse membran, med eller uten nervecellene behandling; og immunofluorescence flekker å vurdere neuronal overlevelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lillehjernen Slice kultur er et kraftig verktøy for å studere programmert Purkinje celle død under postnatal utvikling. Denne teknikken kan brukes til å raskt skjermen kandidat molekyler for deres nervecellene potensial. Den største fordelen er at oppsettet er enkelt og svært kostnadseffektivt, og krever bare en beskjeden investering i utstyr (en vibratome kan koste opptil 3 ganger mer enn et vev helikopter). Dessuten, 10 å 15 rask skive kan utviklet fra ettall musen pup, tillater for annerledes analyser å bli ut…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imaging arbeidet ble utført ved Northwestern University Center for Advanced mikroskopi sjenerøst støttet av NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker Sean McDermott for sin tekniske assistanse og støtte, og Maya Epstein for hånd-tegnet illustrasjoner vist i figur 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson’s disease. Neurosciences. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neurosciences. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells’ and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
